野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其驗(yàn)證

萬(wàn)祿明，李素波，贠志敏，張 雪，高紅偉，宮 鋒，檀英霞

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850）

1975年，Magnus等[1]在大鼠肝中發(fā)現(xiàn)了一種可以降解硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的內(nèi)切糖苷酶，隨后其被命名為乙酰肝素酶（heparanase，HPA）。之后研究人員在人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、黑素瘤和多種腫瘤細(xì)胞和組織中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有HPA的表達(dá)[2-9]。1999年，3個(gè)研究小組分別從人血小板、胎盤(pán)和黑素瘤中克隆出HPA基因[10-12]。HPA是目前已發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一可以降解HS蛋白聚糖上HS側(cè)鏈的內(nèi)切糖苷酶，通過(guò)降解HS，HPA促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)的降解和重塑[13-14]。

HPA在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的酶活性作用已經(jīng)被廣泛深入地研究[15]，其在乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、腦部腫瘤、頭頸部腫瘤、骨尤文氏肉瘤、胃癌、前列腺癌、腎癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤和B淋巴細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤中的表達(dá)顯著增多[16-18]。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，HPA的高表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)，其主要通過(guò)降解HS而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

關(guān)于HPA的非酶活性，雖然其受體仍未確定，但有報(bào)道HPA可以通過(guò)非酶活性發(fā)揮作用。例如，將HPA的酶活性位點(diǎn)（Glu225和Glu343）由谷氨酸突變?yōu)楸彼岷?，HPA可以通過(guò)激活A(yù)kt相關(guān)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移[19]。此外，在結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，無(wú)酶活性的HPA也可以通過(guò)促進(jìn)Akt和Src的磷酸化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的上調(diào)[20-21]。

為了更好地研究HPA的病理生理功能，尤其是深入探討其酶活性作用和非酶活性作用，本研究采用基因工程的手段構(gòu)建了野生型和E225/343A突變型的HPA慢病毒表達(dá)載體，利用人紅白血病細(xì)胞系HEL對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)驗(yàn)證，為更好地研究HPA在體內(nèi)的病理生理功能尤其是深入探討其酶活性作用和非酶活性作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

DMEM和1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清，上海吉泰依科賽公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α來(lái)自北京全式金生物公司；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物，美國(guó)Thermo Scientific公司；瓊脂糖，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；CloneExpressTMⅡ一步法克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技公司；Taq酶和dNTP，美國(guó)Clontech公司；限制性?xún)?nèi)切酶，美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，美國(guó)Promega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，北京天根公司；小鼠抗人HPA單克隆抗體和小鼠抗人GAPDH單克隆抗體，美國(guó)proteintech公司；HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體（二抗），美國(guó)CST公司；檢測(cè)多配體蛋白聚糖1的ELISA試劑盒來(lái)自武漢博士德公司；小鼠抗人的HS單克隆抗體（抗-10E4表位），英國(guó)amsbio公司；大鼠抗小鼠的PE偶聯(lián)IgM（二抗），美國(guó)Ebioscience公司；lipo293TM轉(zhuǎn)染試劑，碧云天公司；聚凝胺，北京索萊寶公司；嘌呤霉素，大連美侖公司。PCR儀來(lái)自美國(guó)AppliedBiosystems公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像儀來(lái)自美國(guó)Bio-Rad公司；細(xì)菌搖床來(lái)自美國(guó)Thermo Scientific公司；高速離心機(jī)來(lái)自德國(guó)Sigma公司；細(xì)菌培養(yǎng)箱來(lái)自上海一恒公司；流式細(xì)胞儀來(lái)自美國(guó)BD公司；ELISA洗板機(jī)來(lái)自美國(guó)BioTEK公司。

1.2 細(xì)胞、質(zhì)粒和模板

HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HEL細(xì)胞系購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒載體GV358來(lái)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，其元件順序?yàn)閁bi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin，酶切位點(diǎn)為AgeI/AgeI。輔助包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G保存于本實(shí)驗(yàn)室?；驍U(kuò)增模板由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供：在NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索人乙酰肝素酶（HPSE）的mRNA序列，其序列號(hào)為NM_006665，按照基因的CDS序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，利用重疊延伸PCR方法形成模版DNA，然后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆至pEGFP-N1質(zhì)粒載體中。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GV358質(zhì)粒載體的序列信息，以pEGFPHPSE-N1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到待與GV358質(zhì)粒載體進(jìn)行重組反應(yīng)的野生型HPSE基因片段，擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)如下其中斜體部分為交換配對(duì)堿基，下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn)，粗體部分為表達(dá)增強(qiáng)序列，小寫(xiě)部分為HPSE基因CDS區(qū)的擴(kuò)增序列（交換配對(duì)堿基、酶切位點(diǎn)、表達(dá)增強(qiáng)序列均是GV358質(zhì)粒載體上存在的序列，利于之后的重組反應(yīng)；由于HPA后融合表達(dá)了3FLAG標(biāo)簽，所以下游酶切位點(diǎn)的數(shù)目以不引起移碼突變?yōu)闇?zhǔn)）。所有引物由天一輝遠(yuǎn)公司合成。

1.4 定點(diǎn)突變

為了將野生型HPA第225位和343位的谷氨酸（GAA）突變?yōu)楸彼幔℅CA），根據(jù)重疊延伸PCR的思路，設(shè)計(jì)如下幾條引物：P3：5’-CGAGCTCAAGCTTCGAATTCCGCCACCATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGC-3’；P4：5’-TGGTGGCGACCGGTGGATCCCGGATGCAAGCAGCAACTTTGGCATTTC-3’；P5：5’-ACTAGGCAATGCACCTAACAGTTTCCTTAAGAAGG-3’；P6：5’-CTGTTAGGTGCATTGCCTAGTTCCCAAGAAATG-3’；P7：5’-CTGGTTAGGAGCAACAAGCTCTGCATATGGAGGC-3’；P8：5’-AGAGCTTGTTGCTCCTAACCAGACCTTCTTGCCAG-3’。構(gòu)建流程如下：①以pEGFP-HPSE-N1為模板，以P3和P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到710 bp的片段a；②以pEGFP-HPSE-N1為模板，以P5和P8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到376 bp的片段b；③ 以pEGFPHPSE-N1為模板，以P7和P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到635 bp的片段c；④以a+b+c為模板，以P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1678 bp的片段d；⑤以d為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到待與GV358質(zhì)粒載體進(jìn)行重組反應(yīng)的HPSE（E225/343A）基因片段。

1.5 野生型和酶活缺失型HPSE慢病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建

利用AgeI內(nèi)切酶對(duì)GV358質(zhì)粒進(jìn)行酶切，隨后對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。然后線(xiàn)性化質(zhì)粒載體和目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，在ExnaseTMⅡ重組酶的作用下進(jìn)行重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)線(xiàn)性化質(zhì)粒載體和目的基因片段的體外環(huán)化。隨后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別挑取4個(gè)單克隆，擴(kuò)增后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送生工公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將正確克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取高純度質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化子PCR鑒定引物：正向：5’-TCTTTGGAGCAGGAAACTACC-3’（針對(duì)插入片段序列）；反向：5’-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3’（針對(duì)質(zhì)粒載體自有片段序列）。

1.6 慢病毒包裝

慢病毒包裝系統(tǒng)由吉?jiǎng)P基因GV358慢病毒質(zhì)粒載體、psPAX2載體和pMD2.G載體3個(gè)質(zhì)粒組成。GV358慢病毒質(zhì)粒載體除攜帶目的基因序列外，還含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他輔助元件。psPAX2載體中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pMD2.G載體中含有單純皰疹病毒來(lái)源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。

在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度至80%～90%時(shí)，用lipo293TM轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染 45 μg 質(zhì)粒（GV358：psPAX2：pMD2.G=4∶3∶2）至HEK-293T細(xì)胞中。于感染48和72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基，在4℃條件下，3 000×g離心15 min，然后0.45 μm過(guò)濾上清獲得病毒感染液。

1.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

用新鮮培養(yǎng)基將生長(zhǎng)在對(duì)數(shù)期的HEL細(xì)胞系種至6孔板中，每孔加入培養(yǎng)基的量為1 mL，加入濃度為10 g·L-1的聚凝胺1 μL作感染增強(qiáng)試劑，使其終濃度為10 mg·L-1；分別加入0，50，100，200，500和1000 μL的病毒感染液，輕輕混勻后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72 h后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)，拍照并計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞，選取GFP陽(yáng)性率在80%的轉(zhuǎn)染組，換液并按1∶1000的比例加入10 g·L-1的嘌呤霉素，即在終濃度為10 mg·L-1的嘌呤霉素培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

篩選約2周后，獲得GFP陽(yáng)性率接近100%的各組細(xì)胞，其中穩(wěn)轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照細(xì)胞命名為HELCON，過(guò)表達(dá)野生型HPA的細(xì)胞命名為HEL-OE，過(guò)表達(dá)酶活缺失型HPA的細(xì)胞命名為HELMutant OE。

1.8 Western印跡法檢測(cè)HPA過(guò)表達(dá)效果

收集1個(gè)10 cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞，用800 μL的RIPA裂解液，于冰上充分裂解，加入0.25倍體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻后于沸水中煮沸10 min使蛋白變性。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳2 h以分離蛋白，電轉(zhuǎn)1.5 h使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉于室溫封閉2 h后，4℃條件下過(guò)夜孵育一抗（小鼠抗人HPA單克隆抗體以1∶1000稀釋、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體以1∶3000稀釋?zhuān)琓BST洗膜3遍后，室溫條件下以1∶3000的比例孵育二抗，TBST再次洗膜3遍后，加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影、拍照。最后用Bio-Rad凝膠成像軟件分析條帶積分吸光度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參條帶積分吸光度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 過(guò)表達(dá)野生型/酶活缺失型HPA的HEL細(xì)胞中HPA酶活性的比較

1.9.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面HS表達(dá)量的變化

作為一種內(nèi)切糖苷酶，HPA特異性地降解細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)上的HS。因此，利用針對(duì)HS上共有的10E4表位抗體[22-23]，借助流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面HS的表達(dá)量。等量細(xì)胞分別種至10 cm培養(yǎng)皿中，正常培養(yǎng)3 d，收取細(xì)胞，PBS洗1遍后，用100 μL的0.2%BSA重懸，加入1 μL HS抗體，室溫避光孵育15 min。PBS洗1遍后，用200 μL的0.2%BSA重懸，均分為2份，其中1份設(shè)為空白，另1份則加入大鼠抗小鼠的PE偶聯(lián)IgM二抗5 μL，室溫避光孵育15 min。PBS洗滌2遍后，用300 μL的2%多聚甲醛固定細(xì)胞，4℃避光保存，1周內(nèi)流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)。用flowjo軟件分析數(shù)據(jù)，通過(guò)幾何平均熒光強(qiáng)度（Geo MFI）來(lái)表示細(xì)胞表面HS的表達(dá)量。

1.9.2 ELlSA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中多配體蛋白聚糖1的釋放量

此外，作為細(xì)胞表面重要的HSPG，多配體蛋白聚糖1也會(huì)在HPA酶活性的作用下從細(xì)胞表面釋放[24]。等量細(xì)胞分別種至10 cm培養(yǎng)皿中，正常培養(yǎng)3 d，收取細(xì)胞培養(yǎng)基，300×g離心收集。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)多配體蛋白聚糖1在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的含量。在450 nm的條件下讀取各孔吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的A450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式計(jì)算出樣品的多配體蛋白聚糖1濃度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。組間比較用非配對(duì)t檢驗(yàn)。使用PrismGraphPad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒質(zhì)粒載體的驗(yàn)證

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1A）顯示，野生型重組產(chǎn)物（1，2，3和4號(hào)）和酶活缺失型重組產(chǎn)物（5，6，7和8號(hào)）的PCR結(jié)果均為陽(yáng)性。隨后的測(cè)序結(jié)果顯示，與NCBI上HPSE的CDS序列相比，1，2，3和4號(hào)重組產(chǎn)物的序列與HPSE基因完全一致，而5，6，7和8號(hào)重組產(chǎn)物在Glu225（圖1B）和Glu343（圖1C）位點(diǎn)上的序列均由GAA突變?yōu)镚CA，實(shí)現(xiàn)從谷氨酸到丙氨酸的突變。

Fig.1 Construction of wild type and enzymatic activity deficiency heparanase（HPA）lentiviral expression vectors.A：PCR identification results of positive recombinant products（1→4：wild type，5→8：E225/343A mutant）；B：sequencing identification results of E225A（left：wild type，right：mutant）；C：sequencing identification results of E343A（left：wild type，right：mutant）.

2.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)野生型和酶活缺失型HPA的HEL細(xì)胞系的建立

Western印跡結(jié)果（圖2A）顯示，HEL-OE和HEL-Mutant OE均檢測(cè)到了HPA蛋白的過(guò)表達(dá)，其中既包括分子質(zhì)量為65 ku的HPA前體蛋白，也包括分子質(zhì)量為50 ku的HPA成熟蛋白，此結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。半定量結(jié)果（圖2B）顯示，HEL-OE細(xì)胞和HEL-Mutant OE細(xì)胞中65 ku和50 ku的HPA表達(dá)量相當(dāng)。

2.3 過(guò)表達(dá)野生型和酶活缺失型HPA的HEL細(xì)胞中HPA酶活性的比較

細(xì)胞表面HS的檢測(cè)結(jié)果（圖3A和B）顯示，HEL-OE細(xì)胞表面HS表達(dá)量的幾何平均熒光強(qiáng)度（Geo MFI）為 160.0±8.0，較 HEL-CON 細(xì) 胞（345.0±15.2）顯著降低（P＜0.01）；而HEL-Mutant OE細(xì)胞表面HS表達(dá)量的Geo MFI則為353.0±14.0，與HEL-CON細(xì)胞表面HS的表達(dá)量相當(dāng)。

Fig.2 Expression of HPA in HEL cells.A：a representative Western blotting result of the expression of HPA（pre-HPA：65 ku；mature-HPA：50 ku）；B：semi-quantitative result of A.HEL：normal cells；HEL-OE：HEL cells overexpressing wild type HPA；HEL-CON：vector control cells；HEL-Mutant OE：HEL cells overexpressing E225/343A mutant HPA.±s，n=3.

Fig.3 Validation of constructed wild type and enzymatic activity deficiency HPA lentiviral expression vectors in HEL cell line.A：a representative flow histogram for the amounts of heparan sulfate（HS）on cell surface.B：geometry mean fluorescence intensity（Geo MFI）of HS on cell surface.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HEL-CON.C：amounts of syndecan-1 in cell culture supernates.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HEL-CON.

細(xì)胞上清中多配體蛋白聚糖1的檢測(cè)結(jié)果（圖3C）顯示，HEL-OE細(xì)胞培養(yǎng)基中多配體蛋白聚糖1為（59.0±3.8）ng·L-1，較HEL-CON細(xì)胞培養(yǎng)基中的釋放量（32.2±3.9）ng·L-1明顯增多（P＜0.01），而HEL-Mutant OE細(xì)胞培養(yǎng)基中的釋放量為（30.9±2.9）ng·L-1，與HEL-CON細(xì)胞培養(yǎng)基中的釋放量相當(dāng)。

3 討論

HS蛋白聚糖是廣泛存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的一類(lèi)生物大分子，它由核心蛋白和以共價(jià)鍵方式連接在核心蛋白上的HS糖鏈構(gòu)成，參與機(jī)體多種生命活動(dòng)的發(fā)生、發(fā)展與調(diào)控。因此，作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一可以降解HS蛋白聚糖上HS側(cè)鏈的內(nèi)切糖苷酶[25]，HPA在機(jī)體的生理病理活動(dòng)中發(fā)揮多種重要作用。

早在2000年，Hulett等[26]就鑒定出HPA的酶活性存在于Glu225和Glu343位點(diǎn)，隨后Goldshmidt和 Nadir等[27-28]通過(guò)基因編輯的手段將 Glu225和Glu3432個(gè)位點(diǎn)的谷氨酸突變?yōu)楸彼幔‥225/343A），在不影響HPA蛋白表達(dá)的同時(shí)，成功清除了HPA的酶活性。此后，雖然研究者逐漸注意到除了酶活性作用，HPA的非酶活性作用也具有重要研究?jī)r(jià)值[19-21]，但大部分區(qū)分HPA酶活性作用和非酶活性作用的研究都是通過(guò)放射性同位素標(biāo)記HS的方法來(lái)作出判定，方法繁瑣并存在安全隱患；相比之下，直接構(gòu)建野生型和酶活缺失型的HPA過(guò)表達(dá)載體，可以更加便捷清晰地區(qū)分和判定HPA的酶活性作用和非酶活性作用，并有助于對(duì)HPA的酶活性作用和非酶活性作用展開(kāi)系統(tǒng)性研究。

因此，為了更深入地研究HPA的生理病理作用，本研究以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)，借助慢病毒感染技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，成功構(gòu)建了野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒表達(dá)載體。慢病毒載體是以人類(lèi)免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，它可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可實(shí)現(xiàn)目的基因的長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的首選。本研究以pEGFP-HPSE-N1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增HPA基因，用重疊延伸PCR的方法實(shí)現(xiàn)了HPA蛋白序列上第225位和第343位谷氨酸向丙氨酸的突變；利用無(wú)縫克隆的方法將目的基因片段與GV358慢病毒質(zhì)粒載體進(jìn)行拼接；隨后用PCR和進(jìn)一步的測(cè)序?qū)嶒?yàn)對(duì)序列進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。最后，用構(gòu)建好的野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒感染HEL細(xì)胞，并利用Western印跡實(shí)驗(yàn)證明了野生型和酶活缺失型HPA蛋白的正常表達(dá)，而酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，相對(duì)于能夠有效切割HS的野生型HPA，酶活缺失型的HPA失去了切割細(xì)胞膜表面HS的能力。

綜上所述，本研究為深入探討HPA酶活性作用和非酶活性作用提供了慢病毒表達(dá)工具，考慮到HPA是機(jī)體唯一可以切割HS的內(nèi)切糖苷酶，這一工具將有助于揭示HPA在調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮的重要作用及其機(jī)制。