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    2-吲哚啉酮衍生物預(yù)防給藥對(duì)放射性肺纖維化模型小鼠的防護(hù)作用

    2019-06-18 08:14:22李婉瑩高慧英劉金芳2詹軼群楊曉明3李長(zhǎng)燕
    關(guān)鍵詞:肺纖維化膠原肺泡

    李婉瑩,高慧英,劉金芳2,,高 瑞,陳 慧,詹軼群,楊曉明3,,李長(zhǎng)燕

    (1.安徽醫(yī)科大學(xué),安徽 合肥 230032;2.北京正旦國(guó)際科技有限公司,北京 102206;3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850;4.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所,北京 102206)

    肺是照射敏感器官[1],照射對(duì)肺造成的損傷為進(jìn)展性的,分為2個(gè)階段。前一階段是放射性肺炎,主要表現(xiàn)為照射造成的DNA斷裂損傷,Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞直接死亡,氧自由基增多,炎癥細(xì)胞和炎癥因子浸潤(rùn)等[2-4]。后一階段是放射性肺纖維化(radiation pulmonary fibrosis,RPF),這一階段至今仍被認(rèn)為是不可逆轉(zhuǎn)的[3]。在臨床上,大量肺癌患者,尤其是非小細(xì)胞性肺癌患者需要采用放射治療,通常會(huì)伴隨肺部放射性損傷[1,5]。除此之外,暴露于照射環(huán)境也會(huì)造成肺部急、慢性損傷[5]。RPF為不可逆過程,現(xiàn)有治療如糖皮質(zhì)激素治療、氧療和抗肺纖維化藥物(吡非尼酮、尼達(dá)尼布)等僅能延緩或改善癥狀[4,6-7],嚴(yán)重制約了肺癌患者放療效果,降低患者生存率。如何減輕放射對(duì)肺造成的損傷,提高患者生存質(zhì)量,是亟待解決的臨床問題。2-吲哚啉酮衍生物〔3-(3-pyridylmethylidene)-2-indolinone,PMID〕是基于核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nfr2)/Keap1通路篩選出的小分子化合物(C14H10N2O,相對(duì)分子質(zhì)量為222.24),為無(wú)定型結(jié)晶黃色粉末,具有抗氧化的作用[8-9]。本研究采用小鼠全胸單次放射的方法制備RPF模型,并設(shè)置給藥組和對(duì)照組,在長(zhǎng)期觀察后通過肺功能檢測(cè)和病理學(xué)等方法對(duì)小鼠肺纖維化程度進(jìn)行分析,進(jìn)而評(píng)估PMID對(duì)RPF的防護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和主要儀器

    6~8周齡C57BL/6J雌性小鼠72只,SPF級(jí),購(gòu)于北京維通利華(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2006-0006,平均體質(zhì)量約為(18.7±0.8)g。

    PMID(軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所合成),批號(hào)為20160901,純度99.22%;吡非尼酮(pirfenidone,PFD)(大連美侖生物有限公司);Masson三色染色試劑盒(貨號(hào)G1340,北京索萊寶科技有限公司);4%多聚甲醛、羧甲纖維素鈉(CMC-Na)、戊巴比妥鈉和生理鹽水注射液(石家莊四藥有限公司);兔抗Ⅰ型膠原蛋白(alpha 2 chain of typeⅠcollagen,COL1A2)抗體(貨號(hào)A5786,武漢愛博泰克生物科技有限公司);兔二步法檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)PV-9001)和DAB顯色液(貨號(hào)ZLI-9017)(北京中杉金橋有限責(zé)任公司)。

    AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司),NanoZoomer 2.0-HT(日本濱松),Olympus IX71顯微鏡,Co60照射源(軍事醫(yī)學(xué)研究院)。

    1.2 小鼠放射性肺纖維化模型的制備及處理

    72只6~8周齡C57/6J雌性小鼠隨機(jī)取60只進(jìn)行造模,其中12只為正常對(duì)照。造模前禁食12 h,用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,麻醉劑量為0.6 mg·kg-1,麻醉后將小鼠固定,使其胸部基本位于同一水平,暴露其兩腋下至胸骨劍突部位,照射部位面積約2 cm×2 cm,其余部位鉛磚屏蔽,采用Co60經(jīng)前胸單次照射,照射劑量為17.5 Gy,照射劑量率為104.53 cGy·min-1。

    造模后,隨機(jī)分為模型對(duì)照組(0.5%CMC-Na)、PMID7.5,15.0和30.0mg·kg-1組及PFD15.0mg·kg-1組。實(shí)驗(yàn)前1周ig給藥,每天2次,間隔6 h,連續(xù)給藥2周。同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組(0.5%CMC-Na),以上小鼠均飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物飼養(yǎng)中心屏障環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào):SYXK(軍)-2007-004。

    1.3 肺功能檢測(cè)

    用力肺活量(forced vital capacity,F(xiàn)VC)和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(pulmonary dynamic compliance,Cydn)是評(píng)估肺纖維化的2個(gè)經(jīng)典肺功能指標(biāo)。照射后26周,1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,麻醉劑量為0.75 mg·kg-1,麻醉后切開小鼠喉部正中,鈍性分離至氣管暴露,在第3~4軟骨環(huán)處做T型切口,插入氣管插管后用縫合線在氣管外打結(jié)固定,與體描箱氣路相連后關(guān)閉體描箱,采集數(shù)據(jù)。

    1.4 HE染色檢測(cè)小鼠肺泡病理變化及Masson染色檢測(cè)膠原沉積

    左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)脫水、浸泡、包埋和切片(5 μm),對(duì)切片進(jìn)行HE染色,經(jīng)掃描后,根據(jù)Ashcroft肺纖維化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10-11],在10倍鏡下以組織學(xué)特征為依據(jù)對(duì)HE片進(jìn)行全片連續(xù)評(píng)分,將肺纖維水平分為0~8個(gè)等級(jí),取平均值為該片評(píng)分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

    Tab.1 Criteria for grading lung fibrosis(HE staining)

    Masson染色常用于評(píng)估膠原沉積,大分子如膠原纖維被染成藍(lán)色,而小分子如肌纖維、胞漿等則被染成紅色。對(duì)小鼠肺組織切片進(jìn)行Masson染色,并運(yùn)用Image J軟件對(duì)藍(lán)染組織面積比例進(jìn)行量化分析。

    1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)

    COL1是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白產(chǎn)物,可作為肺纖維化程度評(píng)估的重要指標(biāo),采用免疫組織化學(xué)染色的方法特異性染COL1A2檢測(cè)COL1的表達(dá),對(duì)肺組織病理切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理、抗原修復(fù)、阻斷過氧化物酶處理、BSA封閉后,一抗(1∶300)工作液37℃孵育1 h,孵育對(duì)應(yīng)的二抗工作液37℃,1 h后進(jìn)行DAB顯色,顯微鏡下控制顯色時(shí)間,蘇木素染核后脫水封片,掃描。

    1.6 RT-PCR檢測(cè)COL1A2 mRNA的表達(dá)

    用RT-PCR定量檢測(cè)COL1A2mRNA的表達(dá),從肺組織中提取總RNA,采用Thermo Scientific Revert Aid RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,COL1A2引物F:ATGTGCCACTCTGACTGGAA;R:TCCATCGGTCATGCTCTCTC。使用Agilent Mx3000P qPCR System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),采用2-△△Ct法表示待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示,通過GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠放射性肺纖維化模型的鑒定

    模型組小鼠經(jīng)過全胸單次照射后4~6周,照射區(qū)域毛發(fā)開始變白,持續(xù)至26周(圖1A)。解剖后可見正常對(duì)照組小鼠肺呈淡粉色,形態(tài)正常,而模型組小鼠肺則有不同程度損傷,部分有發(fā)白、萎縮的情況出現(xiàn)(圖1B)。照射后小鼠生存率呈2個(gè)階段性下降,在終點(diǎn)第27周,模型組小鼠生存率為45%,中位生存期為178 d(圖1C),照射后2周小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)明顯下降,之后有所回升,照射后第26周,模型組小鼠平均體質(zhì)量低于20 g,明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)(圖1D和E)。評(píng)估了照射26周后小鼠肺功能情況。結(jié)果顯示模型組小鼠肺功能受到嚴(yán)重?fù)p傷,相較于正常對(duì)照組小鼠,F(xiàn)VC明顯下降(P<0.01)(圖1F),Cydn也顯著下降(P<0.01)(圖1G)。HE染色可見未照射小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,Masson染色未見明顯膠原沉積,而照射小鼠則出現(xiàn)嚴(yán)重肺病理?yè)p傷,喪失肺泡正常結(jié)構(gòu),出現(xiàn)大片融合現(xiàn)象,局部表現(xiàn)為完全的纖維化阻塞,Masson染色可見大片藍(lán)染區(qū)域(膠原沉積部位),說明照射小鼠肺部出現(xiàn)嚴(yán)重膠原累積(圖1H和I)??傊?,照射后小鼠肺受到明顯損傷,呈現(xiàn)明顯纖維化改變,表明造模成功。

    2.2 PMlD預(yù)處理可改善放射性肺纖維化小鼠的生存率和體質(zhì)量下降

    Fig.1 Establishment of radiation pulmonary fibrosis(RPF)mouse model.Totally 72 female C57/6J mice aged 6-8 weeks were randomly divided into two groups:the normal control group(n=12)and the model group(n=60).The mice were fasted for 12 h before anesthesia,and the mice were anesthetized with 1%sodium pentobarbital 0.6 mg·kg-1,exposed from underarms to the sternal process of the sternum.A single dose of Co6017.5 Gy whole chest irradiation was performed with a radiation dose rate of 104.53 cGy·min-1.A:appearance of irradiated and non-irradiated mice.After irradiation,the hair in the irradiated area of the mouse turned white,and there was hair loss to different degrees;B:lung appearance of mice(left);C:survival rate of mice(right);D:body mass of mice;E:body mass of mice at the 26thweek after irradiation(the end stage).±s.*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group;F:forced vital capacity(FVC)at the end stage;G:pulmonary dynamic compliance(Cydn)at the end stage;H:HE staining;I:Masson staining.

    照射后,各照射組小鼠出現(xiàn)不同程度的死亡,至27周終點(diǎn)期間,模型組小鼠生存率下降至45%,中位生存期為178 d;PMID 7.5 mg·kg-1組小鼠生存率下降至40%,未見改善;而PMID 15.0 mg·kg-1組、PMID 30.0 mg·kg-1組和PFD組小鼠中位生存期均>189 d(圖2A)其中,PMID 15.0 mg·kg-1組小鼠在終點(diǎn)生存率為73%,較模型組生存率高28%,較PFD陽(yáng)性對(duì)照組生存率高15%(圖2B)。小鼠的死亡主要集中在照射后4周內(nèi)及第20周后,而在前一階段,PMID 15.0 mg·kg-1組和PMID 30.0 mg·kg-1組小鼠并未出現(xiàn)死亡(圖2A)。照射后1周內(nèi)各組小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降,并在1周后回升,25周后,模型組小鼠再次出現(xiàn)較明顯體質(zhì)量下降(圖2C)。至27周終點(diǎn),各照射組小鼠平均體質(zhì)量均低于正常對(duì)照組小鼠平均體質(zhì)量,各照射組中模型組平均體質(zhì)量最低(圖2D)。

    2.3 PMlD預(yù)處理可提高放射性肺纖維化小鼠的肺FVC和Cydn值

    Fig.2 Effect of 3-(3-pyridylmethylidene)-2-indolinone(PMlD)on survival rate and body mass of RPF mice.PMID was given 1 week before the experiment,twice a day,at intervals of more than 6 h,for 2 weeks.A:survival rate of each group,staged declines happened within 4 and 20 weeks after irradiation;B:survival rate of model,PMID 15 mg·kg-1and PFD 15 mg·kg-1group;C1-C6:body mass of each group,irradiation mice showed staged declines in 1 to 25 weeks after radiation;D:body mass of each group.±s,n=12,*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05 ,##P<0.01,compared with model control group.

    Fig.3 Effect of PMlD on lung respiratory function of RPF mice at 26 weeks after irradiation.See Fig.2 for the mouse treatment.x ± s,n=12,*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,##P<0.01,compared with model control group.

    肺功能檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示,Co60照射后26周后,與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠FVC值〔(0.26±0.08)mL〕和 Cydn值〔(0.006±0.002)mL·cm-1H2O〕明顯下降(P<0.01);與模型對(duì)照組相比,PMID各組小鼠肺功能下降情況得到明顯改善,其中PMID 7.5和15.0 mg·kg-1組小鼠FVC值分別為0.55±0.09和(0.52±0.05)mL(圖3A),Cydn值分別提升至0.019±0.004和(0.018±0.002)mL·cm-1H2O(P<0.05)。

    2.4 PMlD預(yù)處理可減輕放射性肺纖維化小鼠的肺病理?yè)p傷

    HE染色結(jié)果(圖4)顯示,正常對(duì)照組小鼠肺部結(jié)構(gòu)正常,肺泡間隔無(wú)增厚,血管周圍無(wú)明顯細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)遭嚴(yán)重破壞,失去正常肺泡結(jié)構(gòu),出現(xiàn)大面積纖維化,血管周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),甚至有“蜂窩肺”表現(xiàn)。與模型對(duì)照組相比,PMID各劑量組肺損傷有一定程度緩解,PMID 15.0和30.0 mg·kg-1組肺部基本可見正常結(jié)構(gòu),肺泡壁有不同程度增厚,偶可見纖維帶或小纖維團(tuán)塊。

    肺組織纖維化評(píng)分結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組肺組織纖維化評(píng)分0.84±0.19相比,模型對(duì)照組肺組織纖維化評(píng)分明顯升高,為5.99±0.69(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比,PMID 7.5和15.0 mg·kg-1組肺組織纖維化評(píng)分分別為2.75±0.45和2.65±0.42,明顯低于模型對(duì)照組(P<0.01)。

    2.5 PMlD預(yù)處理可降低放射性肺纖維化小鼠的肺膠原含量

    正常對(duì)照組肺泡間隔幾乎無(wú)膠原沉積(13.54±3.42)%,僅小血管周圍有一定膠原沉積。模型對(duì)照組則可見大量膠原物質(zhì)沉積(52.17±8.39)%(P<0.01)。PMID各給藥組膠原沉積情況相較于模型對(duì)照組有明顯減輕,主要沉積于血管周圍沉積,肺泡壁僅有少量膠原沉積。其中,PMID 15.0 mg·kg-1組〔(15.55±3.40)%〕、30 mg·kg-1組〔(17.94%±4.70)%〕和PFD組〔(12.92±3.50)%〕藍(lán)染組織面積比例較模型對(duì)照組明顯下降(P<0.01)(圖5)。

    2.6 PMlD預(yù)處理可減少放射造成的Ⅰ型膠原形成

    免疫組化結(jié)果(圖6A)顯示,正常對(duì)照組小鼠肺僅氣管周圍有少量COL1A2陽(yáng)性表現(xiàn),而模型對(duì)照組視野內(nèi)可見大量COL1A2陽(yáng)性區(qū)域染色,PMID給藥組和PFD組COL1A2表達(dá)均有所下降,其中,PMID 7.5 mg·kg-1組陽(yáng)性反應(yīng)最弱。

    Fig.4 Effect of PMlD on lung histopathological damage of RPF model mice at the 26thweek after irradiation by HE staining.See Fig.1 for the mouse treatment.B:the semi-quantitative result of A.±s,n=12,*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,##P<0.01,compared with model control group.

    Fig.5 Effect of PMlD on lung collagen deposition of RPF model mice at the 26thweek after irradiation by massion staining.See Fig.2 for the mouse treatment.B:the semi-quantitative result of A.±s,n=12,*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05 ,##P<0.01,compared with model control group.

    Fig.6 Effect of PMlD on expression of COL1A2 of RPF model mice by immunohistochemical staining(A)and RT-PCR(B).See Fig.2 for the mouse treatment.±s,n=4,*P<0.05,compared with normal control group;#P<0.05,compared with model control group.

    RT-PCR的結(jié)果(圖6B)顯示,照射后,各組小鼠COL1A2mRNA均有升高。其中,與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組COL1A2mRNA表達(dá)上升(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比,PMID 7.5 mg·kg-1組COL1A2mRNA表達(dá)下降(P<0.05),與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果相符,說明PMID預(yù)處理可減少輻射造成的COL1形成。

    3 討論

    17.5 Gy Co60單次全胸照射后2周內(nèi)及24周后,照射小鼠體質(zhì)量下降,活動(dòng)減少,嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡。在照射后4周,被照射小鼠開始出現(xiàn)照射區(qū)域皮毛變白的情況。長(zhǎng)期觀察小鼠生存率及體質(zhì)量變化,可見照射小鼠體質(zhì)量始終低于正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量,給予PMID或PFD可在一定程度上減輕小鼠的體質(zhì)量下降;照射后26周,模型組小鼠死亡過半,解剖發(fā)現(xiàn)小鼠肺出現(xiàn)局部肉眼可見損傷,甚至發(fā)白、萎縮;給予小鼠不同濃度的PMID可避免照射后小鼠的早期死亡發(fā)生。侵入性肺功能檢測(cè)結(jié)果說明,給予PMID能顯著改善照射造成的小鼠肺功能下降,并且,PMID 15 mg·kg-1組無(wú)論生存率還是肺功能的改善方面,效果均優(yōu)于PFD。HE染色可見,PMID預(yù)防給藥小鼠肺結(jié)構(gòu)較為正常,肺泡間隔增厚情況相較于模型組有明顯減輕,病理?yè)p傷評(píng)分由模型組的5.99±0.69降至2.88±0.60,說明對(duì)其病理?yè)p傷有明顯改善。Masson染色結(jié)果也說明,給予PMID預(yù)處理能有效減少照射后小鼠肺膠原物質(zhì)沉積。總之,PMID預(yù)防給藥能明顯減輕RPF小鼠肺纖維化病變,且效果優(yōu)于PFD。

    RPF是一種進(jìn)展性肺損傷,伴有慢性炎癥和異常器官修復(fù)[4,7],其特征包括肌成纖維細(xì)胞增生、膠原累積、肺泡間隙增厚和正常肺結(jié)構(gòu)的破壞[12]。模型組小鼠中表現(xiàn)為HE染色片中肺正常結(jié)構(gòu)損壞,肺泡間隔增高;Masson染色片中可見大量膠原纖維累積。異常修復(fù)過程會(huì)使肺失去正常結(jié)構(gòu),原有的肺泡結(jié)構(gòu)和血管組織遭到破壞,影響肺正常呼吸功能,引起肺功能下降、血氧飽和度下降以及肺動(dòng)脈高壓等[6]。在RPF小鼠模型中可觀察到肺纖維化關(guān)鍵指標(biāo)FVC與Cydn的下降。慢性放射損傷本質(zhì)上是一種異常的傷口愈合,越來(lái)越多的證據(jù)表明,損傷表型由慢性炎癥維持,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的過度表達(dá)和激活,從而導(dǎo)致實(shí)質(zhì)細(xì)胞耗竭和過度纖維化[13-14]。

    Nrf2在纖維化病變中起到重要作用。一方面,氧化應(yīng)激是RPF的主要機(jī)制之一[4,7,15-16],Nrf2可與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,促進(jìn)下游抗氧化酶如NADPH醌氧化還原酶和血紅素加氧酶1的表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用,起到保護(hù)細(xì)胞的作用[9,17]。除此之外,Nrf2可阻斷Smad2/3磷酸化,阻礙其復(fù)合物形成,從而抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/Smad信號(hào)通路[18-20],減少下游纖維化產(chǎn)物如COL1等的形成,發(fā)揮其抗纖維化作用[21-22]。本研究結(jié)果顯示,PMID發(fā)揮抗肺纖維化作用可能也與Nrf2對(duì)該通路的抑制作用有關(guān)。

    綜上所述,PMID在RPF模型小鼠中表現(xiàn)出很好的防護(hù)作用,有望成為放射性肺纖維化的新型藥物,具有極大的臨床開發(fā)價(jià)值。

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