依那西普對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜凋亡通路中Fas，TNF-α及caspase-8表達的影響

葉 琴，黃 焱，朱益華

隨著糖尿病患者的不斷增加，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)已成為糖尿病常見的嚴重并發(fā)癥。DR發(fā)病機制復(fù)雜，目前多項研究發(fā)現(xiàn)，多種細胞因子參與了DR的發(fā)病過程，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、IL-1β、干擾素γ(interferon-7，IFN-γ)等[1-3]。Fas，TNF-α及caspase-8是細胞凋亡信號通路的重要因子，共同作用致糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。依那西普是一種細胞表面TNF受體的競爭性抑制劑，可以抑制TNF的生物活性，參與調(diào)節(jié)TNF及其他下游分子(細胞因子、粘附分子或蛋白酶)控制的生物反應(yīng)。本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察依那西普對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Fas，TNF-α及caspase-8表達的影響及依那西普對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜滲漏量的影響，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，清潔級[福建醫(yī)科大學(xué)動物中心，許可證號：No1610240014]，均飼養(yǎng)于標準化動物中心，自由飲水?dāng)z食。采取隨機數(shù)字表法，將60只大鼠隨機分為對照組、模型組、治療組，每組20只大鼠。模型組、治療組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食12 h，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)溶液的方法建立DR模型，模型組和治療組大鼠腹腔注射新鮮配置的1%STZ溶液(STZ+檸檬酸緩沖液)60 mg/kg[4-5]。糖尿病模型確立的標準：72 h后取大鼠尾靜脈測血糖，血糖>16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。DR模型建立后第3天開始，治療組給予大腿前部皮下注射依那西普(濃度0.4 mg/kg)，每天1次，直至實驗結(jié)束。

1.2Western-blot法測定Fas,TNF-α,caspase-8的表達 各組取12只大鼠，麻醉下摘取雙眼眼球，去除眼前段，剝離視網(wǎng)膜組織，用精密天平稱質(zhì)量后，以0.05 mmol/L的冰冷磷酸緩沖液(pH=7.8，含0.01 mmol/L的EDTA)冰浴下制成10%的勻漿用作檢測。凍存的視網(wǎng)膜組織加入裂解液(含5%蛋白酶抑制劑)，充分裂解后，12 000 r/min離心5 min，按蛋白∶上樣緩沖液=4∶1的比例加入上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min后，10 000 r/min離心5 min，即得細胞總蛋白。4 ℃保存?zhèn)溆?。上樣后電泳，調(diào)節(jié)電壓40 V，時間40 min，待溴酚藍條帶進入分離膠后調(diào)電壓90 V，時間80 min。電泳至溴酚藍跑到凝膠底部時終止電泳。轉(zhuǎn)膜電壓100 V轉(zhuǎn)移1 h。轉(zhuǎn)移成功后，把PVDF膜浸泡在封閉液中，置于搖床上，室溫封閉2 h。加入一抗(Fas的濃度1∶800，TNF-α的濃度1∶2 000，caspase-8的濃度1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗滌加入相應(yīng)二抗(Fas,TNF-α,caspase-8的二抗均為1∶2 000)。置于搖床上，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像儀成像，凝膠分析系統(tǒng)觀察拍照、分析。

1.3視網(wǎng)膜伊文思藍(evans blue，EB)滲漏量測定 分別取各組8只大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，參照文獻[6-7]方法檢測視網(wǎng)膜EB滲漏量，了解血視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的破壞程度。用分光光度計測量樣品在620 nm和740 nm波長的吸光度(OD)值。每個樣品測3次，取平均值,建立EB染料濃度在甲酰胺中的標準曲線：

OD凈值=OD620-OD740

2 結(jié) 果

2.1大鼠空腹血糖和體質(zhì)量的變化 與對照組比較，造模后各個時間點模型組、治療組血糖顯著升高，而體質(zhì)量則顯著低于正常組，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表1)；與模型組比較，造模后各個時間點治療組體質(zhì)量增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組血糖無明顯變化，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表1 大鼠體質(zhì)量的變化Tab 1 Changes in weight of rats in each group

表2 大鼠空腹血糖變化Tab 2 Changes in blood glucose of rats in each group

2.2Western-blot定量檢測結(jié)果 對照組、模型組、治療組的Fas，TNF-α及caspase-8表達量組間比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fas的F=6.726，P<0.01；TNF-α的F=12.695，P<0.01；caspase-8的F=25.039，P<0.01)。模型組、治療組的表達量較對照組增強(P<0.01)，治療組的表達量較模型組減少(P<0.01，圖1)。

TNF-α:腫瘤壞死因子;與對照組比較，☆：P<0.05.圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜Fas，TNF-α及caspase-8的蛋白含量的相對表達量Fig 1 The relative protein expression of Fas,TNF-α and caspase-8 in rat retina

2.3視網(wǎng)膜EB滲漏量 EB濃度與凈OD值之間呈高度直線相關(guān):Y=0.070 2 X+0.012 5(r=0.996,P=0.001)；其中Y表示凈OD值，X表示EB濃度。以此計算出各組樣品OD值對應(yīng)的EB質(zhì)量濃度，用濃度乘以300 μL得出視網(wǎng)膜EB滲漏量(ng)。以視網(wǎng)膜干質(zhì)量(mg)標化EB滲漏量(ng)，結(jié)果表示為ng/mg。對照組、模型組、治療組的EB平均滲漏量分別為(2.43±0.24)，(7.93±0.31)及(4.87±0.24)ng/mg，EB平均滲漏量組間比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=854.966，P<0.01)。組間兩兩比較，模型組的平均滲漏量較對照組明顯升高；治療組的平均滲漏量較模型組明顯減少，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

3 討 論

通過給大鼠腹腔注射STZ，本研究成功建立糖尿病模型，模型組與治療組大鼠的血糖全部達到糖尿病的建模要求，在第4，8，12周模型組與治療組的空腹血糖均明顯高于對照組。所有糖尿病大鼠均有多飲、多食、多尿及體質(zhì)量減輕的癥狀，在第4，8，12周模型組與治療組的體質(zhì)量均明顯低于對照組。

目前公認的有三條途徑參加細胞凋亡，即線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑，其中死亡受體途徑是外在凋亡途徑。近年來，死亡受體途徑引起的凋亡，越來越受到研究者的重視。死亡受體眾多，但其信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路卻主要有3條：FAS/FASL途徑、TNFR途徑、TRAIL途徑[8-9]。Fas是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于TNF受體超家族成員；Fas的天然配體(FasL)Ⅱ型跨膜糖蛋白，也屬于TNF家族。

EB:伊文思藍.EB平均滲漏量組間比較，△：P<0.01.圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜EB滲漏量的比較Fig 2 Compared with rat retina EB leakage in each group

caspase 家族是一類半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡的過程中扮演重要角色。caspase 未被激活時以酶原形式存在(pro-caspase)，一旦被激活后就剪切成有活性的亞單位(cleaved caspase)。根據(jù)作用不同，分為起始 caspase 和效應(yīng) caspase 兩個亞類[10]。其中，caspase-8 屬于起始caspase，在Fas/TNF-α死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡中起重要作用。在各種細胞凋亡信號的刺激下，死亡受體活化導(dǎo)致起始酶caspase-8的激活，通過細胞內(nèi)Fas等相關(guān)媒介蛋白調(diào)控，進一步激活其下游效應(yīng)分子caspase-3和caspase-7，從而導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生[11]。

本研究采用 Western-blot 檢測大鼠視網(wǎng)膜死亡受體Fas，TNF-α及其下游的caspase-8，發(fā)現(xiàn)模型組和治療組的Fas，TNF-α及caspase-8的蛋白表達水平均明顯高于對照組，說明凋亡效應(yīng)在糖尿病大鼠早期改變中起了較大作用。治療組的Fas，TNF-α及caspase-8明顯低于模型組，說明依那西普可以減少凋亡。Demircan等應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測DR患者血清及玻璃體中TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)其血清及玻璃體中TNF-α含量均顯著高于正常者[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)TNF-α在DR中表達增加。

TNF-α引起DR發(fā)生發(fā)展的機制可能是由于高血糖環(huán)境下，視網(wǎng)膜代謝發(fā)生異常，導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細血管結(jié)構(gòu)的破壞，造成視網(wǎng)膜缺血缺氧等損傷，并打破視網(wǎng)膜血管生長因子和抑制因子之間的平衡狀態(tài)，使TNF-α等促血管生成因子增加，導(dǎo)致DR新生血管生成等一系列病變。依那西普是一種細胞表面TNF受體的競爭性抑制劑，抑制TNF的生物活性并阻斷TNF通道的細胞反應(yīng)。依那西普可能還參與調(diào)節(jié)由TNF誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)的其他下游分子(細胞因子、粘附分子或蛋白酶)控制的生物反應(yīng)。Antonia等的研究認為，TNF-α介導(dǎo)的細胞凋亡在早期的DR和長期的組織病理學(xué)改變中的作用[13]，證實依那西普能減少細胞凋亡及減輕DR。筆者的研究結(jié)果與此一致。

高血糖環(huán)境下機體細胞代謝發(fā)生異常，導(dǎo)致視網(wǎng)膜處于缺血缺氧狀態(tài)，打破了視網(wǎng)膜血管因子和抑制因子之間的平衡，促使分布于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞表面的TNF-α增加，破壞視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接，導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的破壞[14-16]，使血管滲透性增加。另外，TNF-α能增加血管內(nèi)皮VEGF的表達，VEGF能夠干擾視網(wǎng)膜周細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞之間的相互作用，引起新生血管形成及毛細血管通透性增高，導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜滲漏增加等一系列病理改變。TNF-α能提高靶細胞對VEGF,TGF-β及IGF-1等因子的反應(yīng)性，增加VEGF的表達，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管生成及血-視網(wǎng)膜屏障破壞。

本研究采用EB滲漏量測定的方法評價各組大鼠視網(wǎng)膜滲漏情況，發(fā)現(xiàn)模型組和治療組的EB滲漏量較對照組明顯增高，說明大鼠糖尿病早期視網(wǎng)膜滲漏量增加。治療組的EB滲漏量較模型組明顯減少，說明依那西普能夠減輕凋亡及炎癥等機制所致的糖尿病視網(wǎng)膜的滲漏，從而減輕糖尿病視網(wǎng)膜的損傷程度。

綜上所述，在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中死亡受體Fas，TNF-α及下游的caspase-8的蛋白含量較高，依那西普可以抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Fas，TNF-α及caspase-8的表達，減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜滲漏量及炎癥反應(yīng)，從而減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷。