磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3在增生型糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體和血清中的表達(dá)及其相關(guān)性分析△

唐敏 呂紅彬 何躍 歐陽(yáng)科 周琦 田敏 向小紅 曹陽(yáng)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病特異性的眼部微血管并發(fā)癥之一[1]。病理性新生血管形成是DR從非增生型發(fā)展為增生型的關(guān)鍵性事件，當(dāng)前抑制病理性血管形成的研究主要集中于抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，而最新的研究是以阻斷內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解為中心來(lái)抑制新生血管生成。磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(phospofructokinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase 3，PFKFB3)是內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解過(guò)程中的一個(gè)限速性調(diào)節(jié)酶，抑制PFKFB3的表達(dá)可使內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解速率降低，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，從而減少血管萌芽[2]。本研究通過(guò)定量檢測(cè)增生型DR(proliferative DR,PDR)與非DR患者血清和玻璃體中的PFKFB3及VEGF表達(dá)水平，并對(duì)比玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物后相關(guān)指標(biāo)的變化情況，旨在探討PFKFB3在PDR發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料與分組 選取2015年12月5日至2017年1月19日于我科行經(jīng)睫狀體平坦部25G+微創(chuàng)玻璃體切割術(shù)的患者62例62眼。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為PDR，具備手術(shù)指征者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為全層黃斑裂孔(full thickness macular hole，F(xiàn)TMH)及黃斑前膜(preretinal membrane of the macula，PRMM)，并具備手術(shù)指征者。以上患者均排除患有自身免疫性疾病、肝臟損害、肺部疾病、精神性疾病及惡性腫瘤等疾病者，嚴(yán)格按照以上納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入試驗(yàn)組患者42例(42眼)，其中男24例24眼，女18例18眼，年齡46～71(55.43±9.29)歲，并據(jù)患者玻璃體切割術(shù)前是否行玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗而進(jìn)一步分為非注藥組和注藥組。其中，非注藥組16例16眼，男9例9眼，女7例7眼，年齡43～71(54.88±9.46)歲；注藥組26例26眼，男15例15眼，女11例11眼，年齡46～69(55.77±9.35)歲；對(duì)照組患者20例(20眼)，其中FTMH 14例14眼，PRMM 6例6眼，年齡44～70(53.95±10.21)歲。以上各組年齡構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.973)，性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.818)。獲取標(biāo)本前獲得患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書(shū)。所有血清和玻璃體采集均已通過(guò)我院倫理審查委員會(huì)審查。

1.2 主要儀器及試劑 VX-10Ii眼底照相分析儀(日本，KOWA)、Aviso超聲(法國(guó)，光太)、光學(xué)相干斷層成像掃描儀(德國(guó)，Zeiss)、25G+微創(chuàng)玻璃體切割機(jī)(美國(guó)，Bausch Lomb)、手術(shù)顯微鏡(德國(guó)，Zeiss)、-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)，Thermo)、高速離心機(jī)(德國(guó)，Eppendorf)、微量移液槍(德國(guó)，Eppendorf)、水平搖床(美國(guó)，Thermo)、酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo)、PFKFB3和VEGF試劑盒(北京，安迪華泰生物)。

1.3 方法

1.3.1 血清標(biāo)本采集及保存 各組患者于手術(shù)當(dāng)天清晨抽取空腹肘靜脈全血約4 mL，4 ℃靜置1 h，以4000 r·min-1離心10 min，取上清，分裝后放于-80 ℃ 超低溫冰箱中凍存，待測(cè)。

1.3.2 玻璃體標(biāo)本采集及保存 手術(shù)開(kāi)始后建立微創(chuàng)玻璃體切割三通道，切割并收集未經(jīng)稀釋的中央玻璃體，取樣后立即注入1.5 mL消毒微量離心管中，在4 ℃條件下，以14 000 r·min-1離心6 min，取上清，分裝后放于-80 ℃超低溫冰箱中凍存，待測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定各組樣本玻璃體及血清中PFKFB3和VEGF表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間有意義的進(jìn)一步運(yùn)用LSD法對(duì)各組間指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)描述，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析對(duì)各指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組玻璃體、血清中PFKFB3及VEGF表達(dá) 試驗(yàn)組患者玻璃體中PFKFB3的水平為(463.17±381.28)ng·L-1，明顯高于對(duì)照組[(158.43±86.88)ng·L-1](t=4.919，P<0.001)；試驗(yàn)組血清中PFKFB3的水平為(153.45±83.78)ng·L-1，明顯高于對(duì)照組[(92.72±32.42)ng·L-1](t=4.098，P<0.001)。非注藥組患者玻璃體中PFKFB3的水平為(797.29±387.44)ng·L-1，明顯高于注藥組[(257.56±181.49)ng·L-1](t=5.230，P<0.001)，而非注藥組血清中PFKFB3的水平[(164.72±102.57)ng·L-1]與注藥組[(146.52±71.18)ng·L-1]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.679，P=0.501)。

試驗(yàn)組患者玻璃體中VEGF的水平為(1713.50±1386.90)ng·L-1，明顯高于對(duì)照組[(205.52±92.93)ng·L-1](t=7.014，P<0.001)；試驗(yàn)組血清中VEGF的水平為(224.98±168.08)ng·L-1，明顯高于對(duì)照組[(86.80±36.51)ng·L-1](t=5.082，P<0.001)。非注藥組患者玻璃體中VEGF的水平為(3399.72±510.06)ng·L-1，明顯高于注藥組[(675.82±242.57)ng·L-1](t=20.014，P<0.001)，非注藥組血清中VEGF的水平為[(373.40±174.23)ng·L-1]，亦明顯高于注藥組[(133.65±73.10)ng·L-1](t=5.228，P<0.001)。

2.2 各組PFKFB3及VEGF在玻璃體和血清中表達(dá)相關(guān)性 非注藥組、注藥組和對(duì)照組患者玻璃體與血清中的PFKFB3水平無(wú)相關(guān)性(非注藥組：r=0.194，P=0.471；注藥組：r=0.071，P=0.731；對(duì)照組：r=0.254，P=0.279)。

非注藥組、注藥組和對(duì)照組患者玻璃體與血清中的VEGF水平均存在正相關(guān)關(guān)系(非注藥組：r=0.952，P<0.001；注藥組：r=0.423，P=0.031；對(duì)照組：r=0.776，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

非注藥組、注藥組和對(duì)照組患者玻璃體中PFKFB3與VEGF水平均存在正相關(guān)關(guān)系(非注藥組：r=0.865，P<0.001；注藥組：r=0.587，P=0.002；對(duì)照組：r=0.807，P<0.001)，而在血清中僅注藥組的PFKFB3與VEGF水平存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.444，P=0.023)，非注藥組和對(duì)照組均無(wú)明顯相關(guān)性(非注藥組：r=-0.130，P=0.631；對(duì)照組:r=0.045，P=0.849)，見(jiàn)圖2。

圖1 非注藥組、注藥組和對(duì)照組間玻璃體與血清中VEGF濃度散點(diǎn)圖。A：非注藥組；B：注藥組；C：對(duì)照組

圖2 非注藥組、注藥組和對(duì)照組PFKFB3與VEGF濃度散點(diǎn)圖。A：非注藥組(玻璃體中)；B：注藥組(玻璃體中)；C：對(duì)照組(玻璃體中)；D：注藥組(血清中)

3 討論

PFKFB3是PFKFB家族的一員，被稱(chēng)為人體新陳代謝的“調(diào)節(jié)器”[3]。在低氧環(huán)境、炎癥因子或生長(zhǎng)因子的刺激下，PFKFB3表達(dá)增多，可明顯提升糖酵解速率[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞出芽和分裂所需的80%以上能量供應(yīng)是來(lái)自于糖酵解而非氧化代謝[5-6]，并且在內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖時(shí)，其糖分解速率將會(huì)提高2倍[5]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解途徑可能成為調(diào)節(jié)新生血管形成的一個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，而PFKFB3作為內(nèi)皮細(xì)胞糖代謝中的重要調(diào)節(jié)酶，其在新生血管的形成過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者玻璃體和血清中PFKFB3的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，提示PFKFB3可能參與了PDR的發(fā)生發(fā)展。DR中視網(wǎng)膜缺血缺氧是促進(jìn)新生血管形成的最強(qiáng)刺激因素，Xu等[7]將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞置于低氧環(huán)境下(氧體積分?jǐn)?shù)為0.5%)，其PFKFB3 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，表明缺血缺氧條件下，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的PFKFB3表達(dá)明顯增高。本研究中，試驗(yàn)組和對(duì)照組玻璃體與血清中PFKFB3含量無(wú)相關(guān)性，這表明PDR患者玻璃體內(nèi)相對(duì)高濃度的PFKFB3可能來(lái)源于局部眼內(nèi)組織，如視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞等的高表達(dá)。PFKFB3作為糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。高糖作用下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞處于病理狀態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，使得局部玻璃體中可檢測(cè)到濃度相對(duì)較高的PFKFB3。

VEGF是目前研究最多、作用最明確的促血管生成因子。王歡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PDR組玻璃體VEGF含量較黃斑裂孔組、正常對(duì)照組均明顯升高。Sydorova 等[9]研究表明，PDR組患者血清和玻璃體中VEGF含量均高于增生型玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreous retinopathy，PVR)組和對(duì)照組，而PVR組患者僅在血清中VEGF含量升高，提示PDR患者眼內(nèi)組織大量合成VEGF參與PDR發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組玻璃體與血清中VEGF具有顯著相關(guān)性，這一結(jié)果與Baharivand等[10]研究一致，即PDR組患者血清和玻璃體中VEGF含量均高于對(duì)照組，而且血清與玻璃體中VEGF含量具有顯著相關(guān)性。

玻璃體內(nèi)注射抗VEGF抗體是目前公認(rèn)治療PDR的有效方法，本研究結(jié)果顯示，非注藥組玻璃體和血清中濃度水平均明顯高于注藥組，這與Ma等[11]的研究結(jié)果一致。眼內(nèi)注射抗VEGF抗體可直接結(jié)合玻璃體內(nèi)的游離VEGF從而使測(cè)得的VEGF濃度大大下降。單俊杰等[12]研究顯示，PDR患者玻璃內(nèi)注射貝伐單抗后所有樣本血清中VEGF含量均降低，且在術(shù)后7 d達(dá)最大降幅，術(shù)后28 d VEGF有所上升，但仍未達(dá)術(shù)前水平，這表明局部注射的抗VEGF抗體可到達(dá)血液循環(huán)從而引起血清VEGF水平的下降。

在血管生成過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和活性受多種基因、分子信號(hào)及代謝途徑共同調(diào)控，其中包括VEGF和PFKFB3[13-15]。Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可促進(jìn)PFKFB3的表達(dá)，且VEGF同時(shí)在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)PFKFB3進(jìn)行調(diào)控。另外，PFKFB3抑制劑可以擴(kuò)大阻斷VEGF的效應(yīng)。因此，VEGF可能是PFKFB3的上游信號(hào)分子，它們相互作用共同調(diào)節(jié)血管新生過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，非注藥組玻璃體中PFKFB3含量明顯高于注藥組，與兩組間玻璃體中VEGF含量變化趨勢(shì)一致，且PFKFB3含量與VEGF含量具有顯著相關(guān)性。而各組間血清中僅注藥組PFKFB3與VEGF含量變化具有相關(guān)性，這可能是因?yàn)槭褂每筕EGF藥物減少VEGF與VEGF受體的結(jié)合，減弱VEGF對(duì)PKFKB3表達(dá)的上調(diào)作用，而血清中VEGF的濃度下降并未引起血清PFKFB3表達(dá)水平的改變，其原因可能是由于局部玻璃體內(nèi)注射的抗VEGF藥物經(jīng)血循環(huán)進(jìn)入全身的量不足以引起PFKFB3表達(dá)量的改變。加之PFKFB3作為糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，而在血清中可檢測(cè)的量是十分有限的。

目前，有關(guān)于PFKFB3在DR中作用的研究尚十分有限，但從迄今已有的研究來(lái)看，通過(guò)抑制PFKFB3而減少病理性新生血管形成來(lái)在延緩DR可能成為有效的治療策略。