枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導(dǎo)L-02 肝細(xì)胞氧化損傷的抗氧化作用

黃素瓊 侯英 王曉棟 李波 劉友平 魏嵋

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（四川瀘州646000）；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（四川瀘州646000）；3西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（四川瀘州646000）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）主要因長期大量飲酒引起，早期表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等［1-3］。ALD 在我國目前已是繼病毒性肝炎之后的第二大肝臟疾患，且目前西醫(yī)藥對ALD的逆轉(zhuǎn)治療效果不佳，這給個人、家庭及社會帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)［4-5］。近年來，本院著名全國名老中醫(yī)孫同郊根據(jù)瀘州地域特點，并結(jié)合大量的臨床經(jīng)驗，得出了藥食同源的專方——枳葛解酒方，目前已將該方制成濃縮口服液——“枳葛口服液”，在一定范圍內(nèi)使用，其療效和口感均得到普遍好評，前期動物實驗表明枳葛口服液能減輕乙醇誘導(dǎo)的肝功能損傷，降低血脂，減少血清中炎癥因子，其發(fā)生作用機制可能與肝臟參與氧化應(yīng)激的調(diào)控有關(guān)［6］。ALD的發(fā)病機制及其復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激在ALD的發(fā)生中起到了核心作用［7］。因此，往往通過檢測肝細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力能準(zhǔn)確地反映肝臟抗氧化應(yīng)激的水平，檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的活性反映肝臟氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷程度［8-9］。為了進(jìn)一步確定在酒精性肝損傷過程中枳葛口服液是否參與氧化應(yīng)激的調(diào)控，本研究采用乙醇對L-02 肝細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并同時加用枳葛口服液含藥血清進(jìn)行干預(yù)，觀察枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導(dǎo)L-02 肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ROS 及抗氧化酶SOD 活力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料清潔級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量175～215 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（川）2013-065。枳葛口服液由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格20 mL× 6 支/盒，處方組成有枳椇子、葛根、山楂等，有效期2年，批號20171026。人正常肝細(xì)胞株（L-02 肝細(xì)胞），由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室提供。普通飼料由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；SOD、MDA 及ROS 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自美國ZEALWAY 公司。本實驗經(jīng)過本院倫理委員會的審批。

1.2 方法

1.2.1 枳葛口服液含藥血清的制備根據(jù)《動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表》換算出每只大鼠所需藥物劑量并參照吳健等［10］提出的具體給藥劑量公式：給藥劑量=在體試驗的給藥劑量×反應(yīng)系統(tǒng)中被稀釋的倍數(shù)，最終按大鼠用藥劑量的10 倍灌胃，即枳葛口服液組［8.85 g 生藥/（100 g 體質(zhì)量·d）］，對照組（等體積的生理鹽水），每日早、晚各灌胃1次，連續(xù)5 d。于最后一次給藥1 h 后利用2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）麻醉全部大鼠于腹主動脈取血，將所得血液在室溫下靜置2 h，3 000 r/min 離心10 min，將組內(nèi)血清混合，利用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后置-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 L-02 肝細(xì)胞氧化損傷造模將細(xì)胞消化后對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)使最終密度為2 × 1110個/mL 并接種于6 孔板中，實驗分為8個組，即對照組和7個不同乙醇濃度組（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%），每組設(shè)6個復(fù)孔，分別干預(yù)L-02 肝細(xì)胞6、12、24 h，根據(jù)細(xì)胞活力及L-02 肝細(xì)胞中MDA和ROS 水平以確定乙醇造模的最佳濃度及作用時間。

1.2.3 枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導(dǎo)L-02 肝細(xì)胞氧化損傷的抗氧化作用將細(xì)胞消化后對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)使最終密度為2 × 105個/mL 并接種于6 孔板中，實驗分為6 組，對照組（10%正常大鼠血清培養(yǎng)）、模型組（10%正常大鼠血清+2.5%乙醇培養(yǎng)）和4 組不同濃度的枳葛口服液含藥血清（ZGG 1.25%、ZGG2.5%、ZGG5%、ZGG10%）與2.5%乙醇（YC2.5%）（即ZGG1.25% + YC2.5%組、ZGG2.5% +YC2.5%組、ZGG5%+YC2.5%組、ZGG10%+YC2.5%組）分別處理L-02 肝細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞。每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.4 實驗指標(biāo)檢測用CCK8 法檢測細(xì)胞活力，同時采用硫代巴比妥酸法測定L-02 細(xì)胞中MDA的含量，采用熒光酶標(biāo)儀檢測ROS 水平，硫代巴比妥酸法測定細(xì)胞中SOD的活力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計描述計量資料采用表示。計量資料均數(shù)之間的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用最小差異顯著法（least significance of difference，LSD法）。統(tǒng)計軟件為SPSS 19.0，以P＜0.05 時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙醇對L-02 肝細(xì)胞氧化損傷造模濃度及時間的篩選不同濃度乙醇干預(yù)6、12、24 h 后，細(xì)胞存活率隨著乙醇濃度的增加及作用時間的延長呈逐漸下降趨勢，當(dāng)乙醇濃度為5%時，細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05，表1），而L-02 肝細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 隨著乙醇濃度的增加而升高，當(dāng)乙醇濃度在2.5%～5%時，與對照組相比，干預(yù)24 h 后MDA、ROS 含量均明顯升高（P＜0.05，表2、3）。結(jié)合細(xì)胞活力最終選取2.5%乙醇濃度作用24 h 復(fù)制L-02肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。

2.2 不同濃度枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導(dǎo)L-02 肝細(xì)胞氧化損傷的抗氧化作用不同濃度的枳葛口服液含藥血清與2.5%乙醇（即ZGG1.25%+YC2.5%組、ZGG2.5%+YC2.5%組、ZGG5%+YC2.5%組、ZGG10% + YC2.5%組）共孵育細(xì)胞24 h 后，與對照組相比：僅枳葛口服液含藥血清最低劑量組（ZGG1.25% + YC2.5%組）的細(xì)胞存活率、細(xì)胞中MDA、ROS 及SOD 含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余各組細(xì)胞存活率隨著枳葛口服液含藥血清濃度的增加呈逐漸下降趨勢，但存活率均在75%以上（P＜0.05），且各組細(xì)胞中MDA、ROS 含量隨著枳葛口服液含藥血清濃度的增加呈逐漸增多趨勢（P＜0.05），各組細(xì)胞中SOD 含量隨著枳葛口服液含藥血清濃度的增加呈逐漸減少趨勢（P＜0.05），即枳葛口服液含藥血清濃度越高，以上指標(biāo)越接近于模型組（表4、5 及圖1）。因此，1.25%枳葛口服液含藥血清濃度對乙醇誘導(dǎo)L-02 肝細(xì)胞氧化損傷的抗氧化作用是最佳的。

表1 不同濃度乙醇干預(yù)6、12、24 h 后對L-02 肝細(xì)胞活力的影響（n=6）Tab.1 Effects of ethanol at different concentrations onthe cell viability of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s

表1 不同濃度乙醇干預(yù)6、12、24 h 后對L-02 肝細(xì)胞活力的影響（n=6）Tab.1 Effects of ethanol at different concentrations onthe cell viability of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別對照組0.5%乙醇組1%乙醇組1.5%乙醇組2%乙醇組2.5%乙醇組3%乙醇組5%乙醇組F 值P 值6 h存活率（%）0.944±0.019 0.935±0.024 0.941±0.008 0.934±0.005 0.938±0.008 0.934±0.004 0.839±0.028*0.774±0.022*119.096＜0.001 OD 值99.78±0.67 97.91±1.87 96.17±1.73*94.02±1.93*96.35±2.54*95.08±1.88*83.14±3.22*77.24±2.65*118.963＜0.001 12 h存活率（%）0.943±0.018 0.928±0.019 0.925±0.018 0.920±0.010*0.861±0.024*0.817±0.020*0.760±0.024*0.708±0.019*180.242＜0.001 OD 值100.00±0.00 94.81±1.74*92.53±1.73*90.83±1.45*83.80±2.20*81.14±1.86*75.62±1.86*70.98±1.89*307.479＜0.001 24 h存活率（%）1.020±0.052 0.990±0.050 0.941±0.008*0.875±0.017*0.837±0.023*0.792±0.022*0.753±0.031*0.633±0.021*148.625＜0.001 OD 值100.00±0.00 97.52±1.06*94.44±1.05*85.56±1.73*79.44±1.13*76.19±1.94*70.72±1.57*64.85±3.87*435.966＜0.001

表2 不同濃度乙醇干預(yù)6、12、24 h 后對L-02 肝細(xì)胞中MDA 含量的影響（n=6）Tab.2 Effects of ethanol at different concentrations on the MDA content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，nmol/mgprot

表2 不同濃度乙醇干預(yù)6、12、24 h 后對L-02 肝細(xì)胞中MDA 含量的影響（n=6）Tab.2 Effects of ethanol at different concentrations on the MDA content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，nmol/mgprot

注：與對照組相比，*P＜0.001

組別對照組0.5%乙醇組1%乙醇組1.5%乙醇組2%乙醇組2.5%乙醇組3%乙醇組5%乙醇組F 值P 值6 h 55.89±1.90 57.67±1.58 57.78±2.33 59.89±1.90*61.67±2.45*60.89±2.37*59.78±1.39*61.89±1.83*10.223＜0.001 12 h 60.78±1.92 59.33±2.00 62.22±2.63 61.78±2.17 60.11±2.20 62.56±3.28 60.33±2.50 61.67±2.12 2.013 0.067 24 h 59.22±2.28 61.67±2.34 61.33±2.91 77.44±1.51*85.11±3.48*114.11±6.09*127.00±3.67*158.44±4.61*908.340＜0.001

表3 不同濃度乙醇干預(yù)6、12、24 h 后對L-02 肝細(xì)胞中ROS 水平的影響（n=6）Tab.3 Effects of ethanol at different concentrations on the ROS content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，U/mg

表3 不同濃度乙醇干預(yù)6、12、24 h 后對L-02 肝細(xì)胞中ROS 水平的影響（n=6）Tab.3 Effects of ethanol at different concentrations on the ROS content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，U/mg

注：與對照組相比，*P＜0.001

組別對照組0.5%乙醇組1%乙醇組1.5%乙醇組2%乙醇組2.5%乙醇組3%乙醇組5%乙醇組F 值P 值6 h 90.33±2.00 91.33±2.12 92.22±2.73 91.00±2.74 90.89±2.03 91.78±2.44 90.44±2.19 91.67±2.45 0.714 0.661 12 h 89.33±1.58 89.78±1.72 91.67±3.28*91.44±1.59 91.89±2.57*92.22±2.44*92.22±2.91*91.67±2.12*1.981 0.071 24 h 90.22±2.44 92.00±2.12 92.78±2.49 94.33±3.24*95.11±3.18**138.00±4.12***183.33±4.24***218.33±6.73***1 527.655＜0.001

表4 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 后對細(xì)胞活力的影響（n=6）Tab.4 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the cell viability of cells after 24hours of incubation ±s

表4 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 后對細(xì)胞活力的影響（n=6）Tab.4 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the cell viability of cells after 24hours of incubation ±s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

組別對照組模型組ZGG1.25%+YC2.5%組ZGG2.5%+YC2.5%組ZGG5%+YC2.5%組ZGG10%+YC2.5%組F 值P 值OD 值0.945±0.012b 0.792±0.022a 0.947±0.009b 0.857±0.031ab 0.732±0.024ab 0.666±0.032ab 211.797＜0.001存活率（%）99.78±0.67b 76.19±1.94a 99.33±1.14b 88.94±1.22ab 82.50±2.36ab 77.68±2.23ab 307.23＜0.001

表5 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 對細(xì)胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影響（n=6）Tab.5 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation ±s

表5 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 對細(xì)胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影響（n=6）Tab.5 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation ±s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

組別對照組模型組ZGG1.25%+YC2.5%組ZGG2.5%+YC2.5%組ZGG5%+YC2.5%組ZGG10%+YC2.5%組F 值P 值MDA（nmol/mgprot）59.00±2.60b 106.22±4.32a 58.44±3.97b 79.89±4.83ab 90.22±6.14ab 102.00±7.02a 186.097＜0.001 ROS（U/mg）90.33±2.91b 152.00±6.24a 89.11±4.86b 97.89±7.42ab 99.56±7.18ab 140.89±10.08ab 146.175＜0.001 SOD（mg/L）86.00±6.42b 46.51±2.25a 83.11±6.97b 71.22±6.33ab 53.13±5.12ab 48.32±4.25a 216.363＜0.001

圖1 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 對細(xì)胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影響Fig.1 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation

3 討論

正常條件下，肝臟本身含有如SOD、過氧化物酶、谷胱甘肽等抗氧化劑以清除多余的自由基，使細(xì)胞氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)保持相對平衡以保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷［11-12］。ALD 中，乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量ROS和活性氮自由基團，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致肝臟損傷［13-14］；同時，當(dāng)大量乙醇進(jìn)入體內(nèi)，通過代謝轉(zhuǎn)化為大量乙醛與肝細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA 發(fā)生整合，形成乙醛加合物，使機體ROS增多，氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，MDA增高，某些抗氧化物質(zhì)如SOD等大量消耗，削弱機體多個器官特別是肝臟的抗氧化能力，進(jìn)一步加重肝臟氧化應(yīng)激損傷［15］。本實驗結(jié)果顯示，2.5%乙醇干預(yù)L-02 肝細(xì)胞24 h 導(dǎo)致細(xì)胞活力減弱，細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活力明顯降低（P＜0.05），MDA、ROS含量均明顯升高（P＜0.05），說明2.5%乙醇干預(yù)L-02 肝細(xì)胞24 h 成功誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，抗氧化物質(zhì)SOD 消耗，削弱了肝臟本身的抗氧化能力，這與其他相關(guān)實驗一致［16-17］。

枳葛口服液方劑由枳椇子、山楂、葛根等六味中藥組成，其中枳椇子、葛根為君藥，二者均有解酒毒、生津解郁之功效［18-19］，研究表明葛根素預(yù)防性給藥能使急性乙醇中毒大鼠海馬及下丘腦SOD活性增高，MDA 含量降低，葛根素對酒精引起的機體內(nèi)氧化反應(yīng)有明顯拮抗作用，可對腦組織細(xì)胞起到保護(hù)的作用［20］。據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明：ALD發(fā)病機制中乙醇及其代謝產(chǎn)物——活性氧及毒素MDA等對肝臟產(chǎn)生毒性作用是罪魁禍?zhǔn)?，而葛花枳椇子均可降低血液中的乙醇濃度?1-22］，本研究結(jié)果顯示，不同濃度的枳葛口服液含藥血清與2.5%乙醇（即ZGG1.25% + YC2.5%組、ZGG2.5% +YC2.5%組、ZGG5%+YC 2.5%組、ZGG10%+YC2.5%組）共孵育L-02 肝細(xì)胞24 h 后，各組與模型組比較，不管是細(xì)胞活力還是氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ROS及抗氧化酶SOD等指標(biāo)均有所改善，且改善程度與枳葛口服液含藥血清濃度呈負(fù)相關(guān)，即濃度最小組（ZGG1.25% + YC2.5%組）逆轉(zhuǎn)乙醇誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞氧化損傷的效果最佳，濃度最小組的以上指標(biāo)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？梢婅赘鹂诜汉幯蹇墒筁-02 肝細(xì)胞內(nèi)抗過氧化酶水平升高，從而提高其抗氧化能力，從而對乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷有明顯拮抗作用，其中，1.25%枳葛口服液含藥血清濃度對乙醇誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞氧化損傷的抗氧化作用最佳。

綜上所述，一定劑量的枳葛口服液對乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷具有一定的阻止及逆轉(zhuǎn)作用，其機制可能與該復(fù)方藥物多靶點、多途徑共同協(xié)同進(jìn)行降酒毒，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活力，清除或降低已吸收乙醇代謝所產(chǎn)生的毒物——MDA、ROS 含量，從而最終達(dá)到有效預(yù)防ALD的發(fā)生發(fā)展。