基于代謝組學方法研究中段小腸切除大鼠模型發(fā)生術(shù)后疲勞的機制

黃烈城 陳紅燕 龐鳳舜 秦有

1廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院（廣州510000）；2廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院外科（廣州510000）

術(shù)后疲勞是指手術(shù)后出現(xiàn)的以乏力、失眠、注意力不集中、抑郁、焦慮等癥狀為主要表現(xiàn)的一組癥候群，是術(shù)后常見并發(fā)癥，也稱為術(shù)后疲勞綜合征，嚴重影響著患者術(shù)后康復和長遠的生存質(zhì)量。目前對術(shù)后疲勞的發(fā)生機制尚未有完全統(tǒng)一的認識，一般認為與手術(shù)后炎癥應(yīng)激、營養(yǎng)障礙、免疫功能低下、神經(jīng)遞質(zhì)含量變化、機體氧化應(yīng)激狀態(tài)、心理狀態(tài)等相關(guān)［1-6］，對于反映術(shù)后疲勞大鼠整體狀態(tài)的具體代謝途徑未作進一步研究。代謝組學作為一種系統(tǒng)的生物學方法可通過測定代謝調(diào)控的小分子代謝變化從而描述機體的整體狀態(tài)，本文采用代謝組學方法研究中段小腸切除大鼠模型發(fā)生術(shù)后疲勞的機制，可以補充現(xiàn)有研究中對術(shù)后疲勞具體代謝途徑的空白，更加全面地認識術(shù)后疲勞，為進一步促進術(shù)后疲勞恢復的藥物和臨床實驗提供實驗室基礎(chǔ)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和試劑超高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)（SCIEX，UK），高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀Triple TOF 5600 plus（SCIEX，UK），高速離心機，動物解剖臺，甲醇，甲酸，乙酸銨等。

1.2 大鼠模型構(gòu)造和血漿樣品采集體質(zhì)量200～240 g 健康SPF 級SD 雄性大鼠20 只，隨機分為模型組和正常組各10 只，廣東省中醫(yī)院中心實驗室提供的大鼠標準伺料，大鼠自由飲水攝食，動物房內(nèi)溫度20～24 ℃，相對濕度50%～60%，光線由實驗室管理員控制明暗各12 h。

模型組采用中段小腸切除方法構(gòu)造術(shù)后疲勞模型［7］，正常組僅予等量水合氯醛麻醉，具體造模方法如下：大鼠禁食12 h 后稱重，10%水合氯醛麻醉后背位固定（0.35 mL/100 g 體質(zhì)量腹腔注射），備皮消毒鋪巾，取腹白線上長約1.5 cm 切口入腹，順系膜將腸管輕提出體外，從空腸起始附著點約10 cm 處開始標記70%中段小腸，絲線結(jié)扎腸系膜動脈截斷血供后切除，用6-0 可吸收線均勻間斷縫合腸管行端端吻合。確認吻合口血運情況良好，無梗阻及腸瘺情況，順腸系膜方向?qū)⒛c管送回腹腔，術(shù)畢關(guān)腹。

術(shù)后第1 天大鼠恢復進食及飲水，術(shù)后第8 天行腹主動脈采血。麻醉后沿腹白線開腹，暴露腹主動脈，一次性采血針插入動脈下段，連接含30 μL 10% EDTA-二鈉的真空采血管采集血液，混勻，4 ℃條件下3 000 r/min 離心10 min，取上層血漿樣品。最終采集的血漿樣品，模型組n=7，正常組n=10，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 血漿樣品預(yù)處理及LC-MS分析血漿樣品于冰上解凍，用120 μL 預(yù)冷的50%甲醇提取20 μL樣品，渦旋1 分鐘，并在室溫下孵育10 min；然后將萃取混合物在-20℃下儲存過夜，4 000 r/min 離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的96 孔板中進行LC-MS 分析。此外，還通過組合10 μL 每種提取混合物來制備樣品QC 樣品用以判斷儀器狀態(tài)。

液相色譜條件：使用ACQUITY UPLC BEH 酰胺柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，UK）進行反相分離。柱溫箱保持在35 ℃，流速為0.4 mL/min，流動相由溶劑A（25 mmol/L 乙酸銨+ 25 mmol/L NH4H2O）和溶劑B（IPA∶ACN=9∶1 + 0.1%甲酸）組成。梯度洗脫條件如下：0～0.5 min，線性變化至95%B；0.5～9.5 min，線性變化至95%～65%B；9.5～10.5 min，線性變化至65%～40%B；10.5～12 min，線性變化至40%B；12～12.2 min，線性變化至40%～95%B；12.2～15 min，線性變化至95%B；進樣體積為4 μL。

質(zhì)譜條件：Q-TOF 在正離子和負離子模式下操作，幕簾氣體設(shè)定為30 PSI，離子源氣體設(shè)定為60 PSI，界面加熱器溫度設(shè)定為650 ℃。對于正離子模式，離子噴涂電壓浮動設(shè)定為5 000 V，對于負離子模式，離子的Ionspray 電壓分別設(shè)置為-4 500 V。質(zhì)譜數(shù)據(jù)以IDA 模式獲得，TOF 質(zhì)量范圍為60～1 200 Da，總循環(huán)時間固定為0.56 s，動態(tài)排除設(shè)定為4 s，采集期間每20個樣品校準質(zhì)量準確度。

1.4 統(tǒng)計學方法LC-MS 原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為mzXML 格式，利用XCMS 軟件做峰提取質(zhì)控，進行峰提取。對提取到的物質(zhì)利用CAMERA 進行加和離子注釋，然后利用metaX 軟件進行一級鑒定，分別使用質(zhì)譜一級信息進行鑒定和質(zhì)譜二級信息與in-house 標準品數(shù)據(jù)庫進行匹配。候選鑒定物質(zhì)分別利用HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫進行代謝物注釋，解釋代謝物的物理化學性質(zhì)、生物功能。使用PCA、PLS-DA等方法篩選出重要差異性代謝產(chǎn)物，進行相關(guān)代謝途徑分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血漿代謝譜分析采用正負離子切換模式采集大鼠血漿樣品代謝譜信息，LC-MS 數(shù)據(jù)使用XCMS 軟件進行峰提取，獲得代謝物離子峰的質(zhì)荷比、保留時間和離子面積等信息，共識別出正離子模式下6 828個離子信息，所得數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理進入下一步分析，圖1 為模型組（A）、正常組（C）大鼠血漿樣品離子色譜圖，圖2 為大鼠血漿樣品的典型總離子流色譜圖（TIC）。

圖1 正常組（A）、模型組（C）離子色譜圖Fig.1 A model group and a normal group ion chromotogram

2.2 差異代謝物統(tǒng)計采用單變量分析差異倍數(shù)（fold-change）和T 統(tǒng)計檢驗得到的p-value 值，結(jié)合多變量統(tǒng)計分析PLS-DA 得到的VIP 值（variable important for the projection），來篩選差異表達的代謝物。差異離子同時滿足條件：（1）ratio ≥2 或者ratio ≤1/2；（2）P value ≤0.05：（3）VIP ≥1。最終得到5 680個差異離子，術(shù)后疲勞大鼠較正常大鼠上調(diào)的差異離子數(shù)目322個，下調(diào)的差異離子數(shù)目580個。

圖2 總離子流色譜圖（TIC）Fig.2 Total ion chromotogram

2.3 多變量統(tǒng)計PCA、PLS-DA 分析主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種降維方法，能將多個變量形成一組新的綜合變量，再從中選取幾個（通常是2～3個），從而盡可能多地反映原有變量信息。PCA 主要用于觀察模型中組間分離趨勢，以及是否出現(xiàn)異常點，同時從原始數(shù)據(jù)上反映組間和組內(nèi)的變異度。對于檢測到的物質(zhì)和鑒定到的代謝物進行PCA 分析，PCA 得分圖主要表示數(shù)據(jù)點的分布趨勢，圖中的每個點代表一個樣本，所有樣本之間的異同體現(xiàn)于得分圖中樣品的分離趨勢或聚集度。模型組術(shù)后疲勞大鼠（A表示）與正常組大鼠（C 表示）在PCA 得分圖上呈現(xiàn)分離趨勢，說明術(shù)后疲勞大鼠與正常組代謝物存在差異（圖3）。PCA 散點負載圖反映導致樣本區(qū)別的變量，其中變量離原點的空間距離越遠，且與得分圖樣本分離軸趨勢一致，則代表變量對模型的影響越大。圖4 為模型組術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠的PCA 散點負載圖。

圖3 術(shù)后疲勞模型大鼠與正常大鼠PCA 得分圖Fig.3 The rat of model group and a normal group scord were obtain Principal Component Analysis

PLS-DA 與主成分分析方法不同，它運用偏最小二乘回歸方法建立關(guān)系模型實現(xiàn)代謝物表達量和樣品類別之間的預(yù)測，最大程度地反映分類組別之間的差異，同時通過計算VIP 值（變量投影重要度）來衡量各代謝物表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助代謝標志物的篩選（一般以VIP≥1.0 為篩選條件）。本研究所建立模型參數(shù)R2=0.992（表示模型解釋能力），參數(shù)Q2=0.879（表示模型預(yù)測能力），說明模型可靠。如圖5 所示：得分圖上兩組大鼠呈明顯分離趨勢，表明血漿代謝譜存在明顯差異，根據(jù)VIP值，并結(jié)合PLS-DA 散點負載圖（圖6）篩選出差異代謝物。

2.4 差異性代謝通路對定量的代謝物和差異的代謝物進行一二級鑒定結(jié)果注釋，并對差異的物質(zhì)一級分子量匹配到的KEGG 編號進行簡單的差異通路分析。結(jié)果顯示術(shù)后疲勞模型大鼠與正常大鼠相比在色氨酸代謝，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，精氨酸和脯氨酸代謝，細胞色素P450 對外源化合物代謝的影響，卟啉和葉綠素、葉酸合成、維生素B6、亞油酸代謝等代謝通路存在明顯差異（P＜0.05，表1）。

圖4 術(shù)后疲勞模型大鼠與正常大鼠PCA 散點負載圖Fig.4 The rat of model group and a normal group PCA scord Scatter load diagram

圖5 術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠PLS-DA 得分圖Fig.5 The rat of model group and a normal group scord were obtain Partial least squares discriminant analysis

圖6 術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠PLS-DA 散點負載圖Fig.6 The rat of model group and a normal group PLS-DA Scatter load diagram

3 討論

代謝組學概念首先由NICHOLSON等［8］提出，其核心在于測定機體不同狀態(tài)下參與代謝調(diào)控的小分子代謝變化，從而描述生物體對內(nèi)外各種刺激做出的應(yīng)答規(guī)律，揭示整體生命的動態(tài)過程和調(diào)控規(guī)律。作為一種系統(tǒng)的生物學研究方法，在疾病診斷、藥理毒理、新藥安全性評價、中藥現(xiàn)代化機理等研究領(lǐng)域得到廣泛運用。

本次實驗中，術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠代謝途徑存在明顯差異，色氨酸是一種必需氨基酸，與人體內(nèi)5-HT（5-羥色胺）的代謝密切相關(guān)。腦內(nèi)5-HT 可能是中樞疲勞的調(diào)節(jié)物質(zhì)，其增多可導致中樞疲勞；同時腦內(nèi)5-HT 水平的升高與長時間運動性疲勞相關(guān)，在對運動性中樞疲勞的研究中使用5-HT 激動劑，結(jié)果顯示服用激動劑的試驗組平均力竭時間較對照組短，表明5-HT 對中樞疲勞具有促進作用。血漿中的5-HT 不能通過血腦屏障，因此必須在腦內(nèi)合成，需要游離色氨酸轉(zhuǎn)運至腦內(nèi)，游離色氨酸的增加促進5-HT的生成，進而引起運動疲勞［9-10］。精氨酸是一種α-氨基酸，通過生物酶催化分解生成人體內(nèi)源性一氧化氮（NO），NO 具有舒張血管、改善血液循環(huán)等生物學功能，研究［11］顯示L-精氨酸體內(nèi)代謝增加NO 水平，通過降低乳酸積累而產(chǎn)生抗疲勞效果。糖類物質(zhì)作為最基本的供能物質(zhì)，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化過程形成的各種中間產(chǎn)物，以及能量供應(yīng)方面的障礙也可能引起疲勞。

表1 術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠差異性代謝通路Tab.7 The rat of model group and a normal group differential metabolic pathways

綜上，中段小腸切除大鼠發(fā)生術(shù)后疲勞的機制可能與色氨酸、精氨酸、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化等代謝途徑變化引起的腦內(nèi)5-HT 合成增多、血液循環(huán)功能減弱、能量供給障礙相關(guān)。本次實驗使用代謝組學方法探討中段小腸切除模型大鼠發(fā)生術(shù)后疲勞機制，補充了現(xiàn)有研究中對術(shù)后疲勞具體代謝途徑的空白，對使用該模型進行更多的藥物及臨床研究具有理論和實用意義。由于目前非靶向代謝物的鑒定基于一級分子量誤差，物質(zhì)的鑒定仍需標準品來做靶向代謝物的驗證，各代謝物的定性及定量仍需進一步實驗研究，而各種藥物及促進術(shù)后疲勞康復的干預(yù)措施如何通過影響代謝途徑取得治療效果是進一步研究的方向。