鐵蘭液體振蕩培養(yǎng)再生與快速繁殖

李志英 符運(yùn)柳 徐立

摘 ?要??以鐵蘭葉片為外植體，誘導(dǎo)獲得脆性愈傷組織，液體振蕩進(jìn)行胚性愈傷組織培養(yǎng)及快速增殖，固體培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體萌發(fā)、不定芽生根，最后移栽成活，實(shí)現(xiàn)了鐵蘭的快速繁殖。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，鐵蘭無菌苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)率90%以上，振蕩后的愈傷組織100%成為胚狀體，體積增殖系數(shù)可達(dá)5.0;90%以上的胚狀體可分化為不定芽，95%以上的不定芽可誘導(dǎo)生根，移栽成活率95%以上。研究結(jié)果表明成功進(jìn)行了鐵蘭的液體振蕩培養(yǎng)及快速繁殖。

關(guān)鍵詞 ?鐵蘭;胚性愈傷組織;液體振蕩培養(yǎng);快速繁殖中圖分類號(hào)??Q949.718.16??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Rapid Propagation of Tillandsia cyanea?‘Bert Through Liquid Shake Culture

LI?Zhiying^{1，2，3}， FU?Yunliu^{1，2，3}， XU?Li^1，2，3*

1.?Institute of Tropical Crop Genetic Resources， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hannan?571737， China;?2.?Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture?and Rural Affairs， Danzhou， Hainan?571737， China;?3.?Hainan Provincial?Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation， Danzhou， Hainan?571737， China

Abstract ?Using the leaf ofTillandsia cyaneaas the explants， the fragile callus was induced. The rapid multiplication of embryonic callus was realized through liquid shake culture. In solid medium， the germination of the embryos and rooting of adventitious shoots were induced respectively. Rooting plantlets were transplanted and survived with high rates. In the optimized culture condition， the induction rate of callus was more than 90%. All the embryonic callus turned into embryos after liquid culture and the induction rate of the explants volume reached 5.0. More than 90% embryos developed into adventitious buds and 95% of the buds rooted after culture in solid medium. The transplanting survival rate was also more than 95%. These results indicated that the liquid oscillation and rapid propagation ofT. cyanea was successful.

Keywords ?Tillandsia cyanea ‘Bert; embryonic callus; liquid shake?culture; rapid propagation

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.014

鐵蘭（Tillandsia cyanea‘Bert）又稱扇鳳梨，屬于鳳梨科（Bromeliaceae）鐵蘭屬，是多年生單子葉植物，鳳梨科植物數(shù)據(jù)庫中記載鐵蘭屬有704個(gè)原生種，經(jīng)過培育用于觀賞的栽培種有60多個(gè)。鐵蘭莖短，植株比較矮小，扇形總苞片可觀賞數(shù)月，為迷你型觀賞性植物，具有很強(qiáng)的凈化空氣的能力，適于盆栽裝飾室內(nèi)，擺放于陽臺(tái)、窗臺(tái)、書桌等，也可懸掛在客廳、茶室，還可做插花陪襯材料。

鐵蘭通常用分株法繁殖，即在開花后萌發(fā)的吸芽發(fā)育到一定大小時(shí)，從母株分離栽種，獲得新的植株^[1]。這種方法繁育種苗周期長，繁殖系數(shù)低，不宜作為鐵蘭種苗批量繁育的方法。利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育鐵蘭種苗是目前較為常用的方法，可通過不定芽增殖途徑獲得批量種苗^[2]，也可通過體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)獲得再生植株^[3]。但已經(jīng)報(bào)道的組織培養(yǎng)技術(shù)，均采用固體培養(yǎng)基，周期相對較長，從取材到批量出苗需要2～3?a時(shí)間，繁育過程中需要投入相對較多的人力和物力進(jìn)行多次批量繼代。

液體振蕩培養(yǎng)技術(shù)周期短，速度快，多用于蘭科植物的快速繁育^[4-6]，亦有其他植物的少量報(bào)道^[7]，但鮮見于鳳梨科植物的組織培養(yǎng)。本研究以鳳梨科植物鐵蘭為材料，在前期固體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，改良了愈傷組織的誘導(dǎo)技術(shù)，探索了其液體振蕩培養(yǎng)技術(shù)，以期為鳳梨科植物種苗的快速繁育及品種培育提供參考。

1??材料與方法

1.1材料

以本實(shí)驗(yàn)室離體保存的鐵蘭無菌試管苗為實(shí)驗(yàn)材料^[2]。

1.2方法

1.2.1 ?愈傷組織的誘導(dǎo)??以鐵蘭無菌苗的葉片為外植體，切掉葉尖及基部葉鞘后，再切成0.5?cm長的段，接種于添加不同濃度6-BA及NAA的MS固體培養(yǎng)基上，每皿10塊，每個(gè)處理10皿。

1.2.2 ?液體振蕩??將葉片誘導(dǎo)形成的易碎的愈傷組織，取0.5?cm見方的團(tuán)塊，輕輕壓碎，接種到液體培養(yǎng)基Ⅰ，即添加0.1～0.5?mg/L?2，4-D的MS液體培養(yǎng)基，50 mL的三角瓶，首次加培養(yǎng)基10?mL，逐代增加，每7?d繼代1次。連續(xù)3次后，接種到液體培養(yǎng)基Ⅱ，即添加0.1～0.3 mg/L?2，4-D和0.01～0.05 mg/L?KT的MS液體培養(yǎng)基，用150?mL三角瓶，50?mL培養(yǎng)基，增殖后改用250?mL三角瓶，100?mL培養(yǎng)基，每14?d繼代1次，每個(gè)處理3瓶。

1.2.3 ?胚狀體萌發(fā)??將經(jīng)過繼代培養(yǎng)得到的胚狀體，接種到添加1.0?mg/L?6-BA及0.01?mg/L NAA的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)90?d，誘導(dǎo)胚狀體萌發(fā)不定芽。每瓶接種5個(gè)胚團(tuán)，每個(gè)處理10瓶?；蛎科拷臃N0.5?mL 胚懸浮液，每個(gè)處理3瓶，解剖鏡下觀察萌發(fā)情況。

1.2.4 ?不定芽生根誘導(dǎo)??待不定芽伸長到2～3?cm時(shí)，將不定芽叢進(jìn)行單株分離，接種到不同的生根培養(yǎng)基，1/2?MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L，培養(yǎng)40 d。每瓶接種5個(gè)芽，每個(gè)處理10瓶。

1.2.5 ?移栽??將生根苗連瓶放置在控溫大棚中煉苗，一周后將苗移出培養(yǎng)瓶外，洗凈小苗根部的培養(yǎng)基，進(jìn)行移栽。取草炭土、椰糠和河沙，按體積比計(jì)為草炭土∶椰糠∶河沙=4∶3∶1的比例配成基質(zhì)，提前澆透水，并覆蓋薄膜保濕。

將已經(jīng)濕透的基質(zhì)進(jìn)行淺翻，然后耙平，并用竹棒打孔，孔深1～2?cm，將小苗根部輕輕放到孔中，并用周圍的基質(zhì)填充，稍壓實(shí)，用噴霧的方法淋定根水。移栽后，覆蓋薄膜保濕，空氣濕度保持95%～100%，基質(zhì)濕度保持80%～90%，7～10?d后逐漸降低到70%;遮陰度60%～70%，7～10?d后逐漸減少到30%。溫度25～32?℃。

1.2.6 ?培養(yǎng)條件??固體培養(yǎng)基添加蔗糖濃度為30?g/L，卡拉膠濃度6?g/L;液體培養(yǎng)基添加蔗糖30?g/L，均于滅菌前調(diào)pH為5.80。固體培養(yǎng)光照強(qiáng)度15～20??mol/（m²·s），溫度（26±1）?℃，光照時(shí)間8 h/d。液體培養(yǎng)為黑暗條件，溫度（25±0.5）?℃，轉(zhuǎn)數(shù)90 r/min。

1.2.7 ?懸浮物體積的測量??將懸浮物搖勻后，利用一次性15?mL無菌移液管，剪掉細(xì)頭，吸取5?mL，靜置5?min，觀察培養(yǎng)物的體積，并計(jì)算每瓶培養(yǎng)物的體積。連續(xù)測量4代，根據(jù)每瓶對應(yīng)的體積及體積差，計(jì)算平均增殖系數(shù)。每個(gè)處理2瓶。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與比較。

2??結(jié)果與分析

2.1愈傷組織誘導(dǎo)及增殖

鐵蘭無菌苗葉片切段后，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)40～50 d，葉片基部分化出易碎的愈傷組織（圖1A），愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)90%以上（表1）;將愈傷組織與葉片分離后，接種到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可進(jìn)行增殖，從而獲得較多的易碎的胚性愈傷組織（圖1 B）。

2.2胚性愈傷組織液體振蕩

將疏松易碎的胚性愈傷組織塊輕輕壓碎，接種到繼代培養(yǎng)基Ⅰ中進(jìn)行黑暗振蕩培養(yǎng)3代后，愈傷組織顏色變淺，分散成黃白色的顆粒（圖1C）。將在培養(yǎng)基Ⅰ中獲得的培養(yǎng)物用培養(yǎng)基Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)物快速增殖，每個(gè)周期的增殖系數(shù)最高為5.0（以體積計(jì)算）（表2）。多數(shù)培養(yǎng)物發(fā)育為較大的胚團(tuán)塊（圖1D），少量細(xì)小，為單個(gè)橢圓形胚（圖1E），成胚率為100%。

2，4-D濃度對胚性愈傷組織發(fā)育具有較為明顯的影響。2，4-D濃度為0.1～0.3?mg/L時(shí)，形成的胚為橢圓形，白色至淺黃色（圖1C）;當(dāng)2，4-D濃度提高到0.5?mg/L時(shí)，胚顏色為黃色，形狀不規(guī)則，畸形胚增多（圖1F）。KT的濃度對培養(yǎng)物的增殖具有影響，隨著KT濃度的提高，增殖系數(shù)增加。但在2，4-D濃度較低時(shí)，存在少量非胚性愈傷組織。當(dāng)KT濃度繼續(xù)提高，多次繼代會(huì)導(dǎo)致液體振蕩培養(yǎng)過程中部分胚狀體發(fā)育為不定芽，導(dǎo)致生長不整齊（數(shù)據(jù)未列）。

因此，根據(jù)本研究的結(jié)果，以2，4-D 0.3?mg/L和KT 0.05?mg/L的組合最好，胚狀體狀態(tài)良好，增殖系數(shù)高。

2.3胚狀體的萌發(fā)

將液體培養(yǎng)所得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基，培養(yǎng)60?d，單個(gè)胚萌發(fā)形成不帶根的芽（圖1G），萌發(fā)率90%以上;大的團(tuán)塊變綠（圖1H）后萌發(fā)出叢生芽，單個(gè)團(tuán)塊萌芽數(shù)都在30個(gè)以上（圖1I），MS+6-BA?1.0/2.0 mg/L+NAA?0.01?mg/L團(tuán)塊萌發(fā)率均可達(dá)100%（表3），但6-BA增加，會(huì)使部分葉片邊緣及表面分化愈傷組織，不利于后期芽的發(fā)育。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，胚狀體的萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA?1.0?mg/L+?NAA?0.01 mg/L。

與已有的報(bào)道相似，鐵蘭胚狀體萌發(fā)形成無根不定芽^[3]，需要進(jìn)一步誘導(dǎo)生根。

2.4壯苗及生根

胚團(tuán)萌發(fā)形成的叢芽數(shù)量太多，需要切分為小叢（圖1J），在胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)60?d左右，不定芽發(fā)育為4～5?cm的壯芽。分離單芽接種到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)30?d左右，可誘導(dǎo)形成1?cm左右的棕色根，每個(gè)芽生根2～5條（圖1K），生根率95%以上（表4）。綜合生根率及生根質(zhì)量，1/2?MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基最適于鐵蘭不定芽生根。

2.5移栽

無菌生根苗在大棚中煉苗后洗凈培養(yǎng)基，定植到事先準(zhǔn)備的基質(zhì)上，遮陰保濕管理，移栽成活率95%以上（圖1L）。

3??討論

鳳梨科植物種類繁多，形態(tài)和生物學(xué)特性差別明顯，而且多數(shù)鳳梨科植物不能產(chǎn)生種子。為了解決鳳梨科植物的繁育問題，菠蘿最早被用于進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得再生植株^[8-9]，后進(jìn)一步誘導(dǎo)菠蘿的葉片分化胚性愈傷組織^[10-11]。與菠蘿相比，鐵蘭的葉片革質(zhì)化程度更大，誘導(dǎo)愈傷組織困難。符運(yùn)柳等^[3]以鐵蘭無菌苗的短縮莖為外植體，通過添加2，4-D和6-BA誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織，并獲得了再生植株。本研究以鐵蘭無菌苗的葉片為外植體，通過添加6-BA和NAA，誘導(dǎo)葉片基部分化出胚性愈傷組織，為鐵蘭的組織培養(yǎng)提供了新的技術(shù)參考。

液體振蕩培養(yǎng)技術(shù)因其快速高效而被應(yīng)用于植物的組織培養(yǎng)，可節(jié)省大量人力物力。迄今，應(yīng)用較為廣泛的是懸浮培養(yǎng)蘭科植物的種子^[6]，原球莖^{[4-5，13-15]}， 也有報(bào)道利用叢生芽進(jìn)行懸浮培養(yǎng)^[16]。代容春等^[7]將固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織在液體中培養(yǎng)12?d，再轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基，可較大程度地提高愈傷組織的分化率及芽數(shù)，為提高較難分化芽的植物的培養(yǎng)提供了借鑒。雖然鳳梨科植物的組織培養(yǎng)已經(jīng)研究多年，但尚未見液體懸浮培養(yǎng)的報(bào)道。

液體振蕩培養(yǎng)所采用的外植體一般要細(xì)碎、分散性良好，增殖潛力大，鑒于此，只有少量種類的作物可以獲得理想的外植體而應(yīng)用液體振蕩培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖，例如，蘭科植物多數(shù)易生成原球莖，可以采用液體培養(yǎng)技術(shù)^{[5，13，17]};有報(bào)道利用叢生芽液體懸浮培養(yǎng)，但是易受組織褐變的影響，繼代次數(shù)有限，只有極少量種類適用^[18]。以上問題的存在及種苗快速繁育的需求，導(dǎo)致需要探索不同類型的外植體以進(jìn)行其他植物的液體懸浮培養(yǎng)。胚性愈傷組織，分為易碎型胚性愈傷組織和致密型胚性愈傷組織，其中易碎型胚性愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，易分離，更適合進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)。大量的胚性愈傷組織還可為突變育種、基因工程育種及資源的超低溫保存提供理想材料^[19]。

本研究利用鐵蘭葉片誘導(dǎo)胚性愈傷組織，進(jìn)行了兩段式液體懸浮培養(yǎng)：第一階段，將葉片誘導(dǎo)獲得的愈傷組織在添加了2，4-D的培養(yǎng)基中短周期（7?d）誘導(dǎo)，形成胚;第二階段，將胚在添加2，4-D和KT的培養(yǎng)基中長周期（14 d）誘導(dǎo)，進(jìn)行胚的增殖，可以進(jìn)行鐵蘭胚的快速繁育，增殖系數(shù)（以體積計(jì)）可達(dá)5.0以上。每個(gè)胚的團(tuán)塊進(jìn)行萌發(fā)后，可形成30多個(gè)不定芽，增殖效率非常高。該結(jié)果表明鐵蘭的懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)建立，為鳳梨科其他植物的懸浮培養(yǎng)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

該研究尚存在一定的不足，即液體懸浮后，胚的萌發(fā)比較緩慢，約90?d;胚萌發(fā)不能直接形成完整植株，需要進(jìn)一步誘導(dǎo)生根;不定芽生長緩慢，60?d高度才能達(dá)到4～5?cm。后續(xù)研究應(yīng)努力縮短胚的萌發(fā)時(shí)間，提高芽的生長速度，直接誘導(dǎo)胚形成完整植株。

致謝本研究材料由國家種質(zhì)資源熱帶作物中期保存庫提供，特此致謝！

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