地毯草黃單胞菌分泌黃原膠的電鏡觀察

鄭梅霞 朱育菁 劉波 陳崢 黃素芳

摘 ?要??為了研究地毯草黃單胞菌（Xanthomonas axonopodis）FJAT-10151產(chǎn)黃原膠的分泌行為，采用比濁法測定地毯草黃單胞菌的生長曲線，干重法測定黃原膠產(chǎn)量，2，4-二硝基苯肼顯色法測定黃原膠中丙酮酸含量變化，通過掃描電子顯微鏡鏡（SEM）和透射電子顯微鏡鏡（TEM）觀察地毯草黃單胞菌產(chǎn)黃原膠的分泌行為。FJAT-10151在發(fā)酵時間0～26 h為對數(shù)期，26～72 h為穩(wěn)定期。菌株FJAT-10151為短桿狀（約2 μm），端生鞭毛（約7.9 μm），菌體外面形成了一層較厚的莢膜，且許多菌體通過黃原膠連在一起，分泌的黃原膠呈棒狀和網(wǎng)狀2種形態(tài)，聚集或纏繞在細胞表面，其含量隨發(fā)酵時間的延長而增加。菌株FJAT-10151發(fā)酵72 h可獲得高品質(zhì)黃原膠，其產(chǎn)量及丙酮酸含量最高。

關(guān)鍵詞 ?地毯草黃單胞菌;黃原膠;顯微觀察;丙酮酸中圖分類號??S31??????文獻標識碼??A

Xanthan Gum Secretedby Xanthomonasaxonopodis

ZHENG Meixia， ZHU Yujing^*， LIU?Bo^*， CHEN Zheng， HUANG Sufang

Agricultural Bio-Resources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou，?Fujian 350003，?China

Abstract ?In order to study the xanthan gum secreted?byXanthomonasaxonopodisFJAT-10151， The growth curve of FJAT-10151 was?determined by the turbidimetric method. The yield of xanthan gum was determined by the dry-weighing method. The content of pyruvic acid was determined by?the?2，4-dinitrobenzene hydrazine chromogenic method.?The secretion of xanthan gum fromX. axonopodiswas studied by SEM and TEM. The result showed that the logarithmic phase and stable phase of FJAT-10151?was?0–26 h and 26–72 h， respectively. FJAT-10151 was a short rod of 2 μm long with 7.9 μm of flagellum on the ends， and formed a thick capsule outside， and many bacteria together with xanthan gum. Xanthan gum had flake and filamentous forms， and gathered or wrapped around FJAT-10151 surface. The yield of xanthan gum increased with the extension of fermentation time. The yield of xanthan gum and pyruvic acid reached the highest at?the fermentation time of 72?h. We could?obtain high quality of xanthan gum at?the fermentation time of 72?h.

Keywords ?Xanthomonasaxonopodis; xanthan gum; microscopic observation; pyruvic acid

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.027

地毯草黃單胞菌（Xanthomonas axonopodis）為典型的植物致病菌。地毯草黃單胞菌會引起細菌性葉斑病^[1]，李淑彬等^[2]報道了紅掌對該病菌高度敏感，離體葉片接種第4天、盆栽植株接種第8天后，病葉率達到100%，紅掌葉片感染地毯草黃單胞菌初期出現(xiàn)水漬狀病斑，之后病斑面積不斷擴大，病斑顏色加深逐漸變成灰褐色，后期整個葉片呈灰褐色腐爛狀態(tài)。地毯草黃單胞也會導致棉豆的白葉枯病^[3]和柑橘潰瘍病^[4]等植物病害，該菌分泌胞外雜多糖黃原膠是致病原因之一^[5-6]。鄭梅霞等^[7]篩選獲得了一株分離自福建順昌黃龍病紅心柚葉片的高產(chǎn)黃原膠的地毯草黃單胞菌。

黃原膠是一種酸性雜多糖^[8]，由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸以及丙酮酸構(gòu)成^[9]，丙酮酸的含量賦予黃原膠良好的擬塑性和低剪切速率下高黏度的特性^[10]，可通過控制黃原膠中丙酮酸的含量調(diào)整多糖的應(yīng)用途徑^[11]。產(chǎn)黃原膠的微生物菌株有野油菜黃單胞菌（Xanthomonascampestris）^[12-14]、菜豆黃單胞菌（Xanthomonasphaseoli）^[15]、錦葵黃單胞菌（Xanthomonasmal vacearum）^[15]、胡蘿卜黃單胞菌（Xanthomonascarotae）^[15]、葡萄黃單胞菌（Xanthomonasampelina）TS206菌株^[16]和少動鞘氨醇單胞菌（Sph ingomonaspaucimobilis）511菌株^[17-18]等。地毯草黃單胞菌分泌黃原膠特性的研究還不系統(tǒng)。

本研究通過測定地毯草黃單胞菌FJAT-10151的生長曲線，利用電子顯微鏡觀察地毯草黃單胞菌發(fā)酵過程分泌黃原膠菌體形態(tài)的變化，研究該菌分泌黃原膠產(chǎn)量及其丙酮酸含量與發(fā)酵時間的關(guān)系，揭示該菌分泌黃原膠的生物學特性，為該菌黃原膠的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

菌種：地毯草黃單胞菌FJAT-10151由本實驗室分離自福建省順昌紅心柚葉片，現(xiàn)保存在中國微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCC No.?10271。培養(yǎng)基：采用篩選獲得菌株FJAT-10151時所用的培養(yǎng)基^[7]：蔗糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.0。主要試劑：濃硫酸、苯酚、丙酮酸、2，4-二硝基苯肼和乙醇均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：xMark酶標儀（購自BioRad公司）、掃描電子顯微鏡（JEOL JSM-6380LV）、透射電子顯微鏡（HITACHI HT7700）。

1.2方法

1.2.1??發(fā)酵液制備??取FJAT-10151單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，30?℃?170 r/min培養(yǎng)12 h，按2%接種量將種子液接種到400 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30?℃?170 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2??生長曲線制作??在30?℃?170?r/min條件下，以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標，細胞發(fā)酵液的吸光度值OD₆₀₀為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3??黃原膠產(chǎn)量測定??取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液，離心分離，取上清，加入3倍體積的冷乙醇，4?℃靜置過夜，離心分離，無水乙醇洗滌3遍，70?℃烘干，稱重。

1.2.4??掃描電子顯微鏡分析??離心發(fā)酵液收集菌體，洗滌，參照陳梅春等^[19]對菌體進行掃描電子顯微鏡觀察。4?℃下，2.5%戊二醛固定18?h，0.1?mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液漂洗，50%～100%乙醇逐級脫水，臨界點干燥。金離子噴涂，掃描電鏡15?kV下觀察。

1.2.5??透射電子顯微鏡分析??離心發(fā)酵液收集菌體，超純水洗滌3次，采用負染法^[20]對不同發(fā)酵時間的菌體進行透射電鏡觀察。用3%戊二醛固定樣品后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后制作銅網(wǎng)底片，再用1%的磷鎢酸染色，干燥后采用透射電子顯微鏡觀察。

1.2.6??黃原膠中丙酮酸含量的測定??采用2，4-二硝基苯肼顯色法^[7]測定黃原膠中丙酮酸的含量：分別取3 mL不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液，離心分離，取200 μL上清，加入1000 μL冷乙醇，充分混勻，靜置過夜，離心分離棄上清得多糖沉淀。向沉淀中加入1 mL去離子水溶解。取復溶的溶液700 μL加入到具塞試管，并加入等體積2 mol/L HCl，充分混勻后沸水浴水解3 h，使黃原膠側(cè)鏈基團中的丙酮酸水解釋放，取50 μL水解液，加入0.25 mL 2 mmol/L 2，4-二硝基苯肼，混勻。之后加入2 mL 1.5 mol/L NaOH溶液，在520 nm處測定吸光值。

2??結(jié)果與分析

2.1地毯草黃單胞菌FJAT-10151生長特性

地毯草黃單胞菌FJAT-10151的生長曲線如圖1所示。OD₆₀₀值與發(fā)酵時間的關(guān)系為OD₆₀₀= 0.4311 lnt+ 0.5873（R²=0.9539）。實驗結(jié)果表明，地毯草黃單胞菌的適應(yīng)期非常短，接種后在較短時間內(nèi)就進入對數(shù)生長期，在對數(shù)生長期間，OD₆₀₀值迅速增大到2.0。

2.2地毯草黃單胞菌FJAT-10151生長過程細胞增殖方式

地毯草黃單胞菌FJAT-10151培養(yǎng)14 h時的生長過程形態(tài)變化如圖2所示。FJAT-10151進行二分裂增殖，首先是菌體長軸不斷加長，由

短桿狀變?yōu)殚L桿狀（圖2A，圖2B），其次是細胞壁和細胞質(zhì)開始從靠近菌體中間位置凹陷，將母細胞分成2個幾乎相等的子細胞（圖2C），最后是細胞膜凹陷將菌體細胞分裂成2個子細胞（圖2D）。

2.3地毯草黃單胞菌FJAT-10151產(chǎn)黃原膠特性

隨著發(fā)酵時間的延長，菌株FJAT-10151黃原膠分泌量逐漸增加，結(jié)果如圖3所示。FJAT-10151發(fā)酵12 h時，黃原膠分泌量為（15.39±0.49） g/L，發(fā)酵48 h時，黃原膠分泌量為（18.92±0.58） g/L;0～120?h的發(fā)酵時間與黃原膠分泌量的關(guān)系方程為：C_XG=3.821?lnt+?2.5488（R²=0.8891）。

2.4地毯草黃單胞菌FJAT-10151分泌黃原膠過程細胞形態(tài)變化

地毯草黃單胞菌黃原膠分泌過程菌體變化如圖4所示。地毯草黃單胞菌FJAT-10151掃描電鏡結(jié)果如圖4A所示，菌體聚集黏連。地毯草黃單胞菌FJAT-10151菌體培養(yǎng)24 h時，菌體長1.3～?2?μm，端生鞭毛約7.9 μm（培養(yǎng)17 h），在二分裂過程中，菌體顯著加長表明細胞壁和細胞膜的擴展速度超過DNA的復制速度，這對黃原膠的合成非常有利，因為黃原膠合成的酶系和磷脂載體都存在于細胞膜上^[21]。FJAT-10151細胞周圍有明顯的黏液層（圖4B，圖4C），且表面疑似有通道（圖4D），黃原膠通過此通道聚集或纏繞在細胞表面，形成厚厚的莢膜。

地毯草黃單胞菌在不同發(fā)酵時間分泌黃原膠特性如圖5所示，黃原膠的生物合成是一個遞增的反饋型代謝合成過程。初始階段菌體細胞周圍的黃原膠的產(chǎn)量與發(fā)酵時間呈正相關(guān)，到17 h可明顯看到菌體周圍厚厚的黏液層，在40、70 h時看不到明顯的黏液層，但是在91 h時又能明顯看到黏液層，即黃原膠的產(chǎn)量先增加后降低，之后又有一定量的增加，原因是一定時期后細胞開始自溶，胞內(nèi)的酶有助于黃原膠的生物合成，所以黃原膠的產(chǎn)量又會增多^[9]。菌株FJAT-10151分泌的黃原膠結(jié)構(gòu)有棒狀（圖6A，圖6B）和網(wǎng)狀（圖6C，圖6D）2種。

2.5地毯草黃單胞菌FJAT-10151分泌黃原膠的丙酮酸含量的變化

不同發(fā)酵時間黃原膠丙酮酸含量的變化如圖7所示，發(fā)酵時間0～26?h，丙酮酸含量在0～?0.56?mg/mL，72?h時達到最大值，丙酮酸含量達0.72?mg/mL。84?h之后，丙酮酸含量回落到0.53?mg/mL以下。以黃原膠中丙酮酸含量為指標選擇的最佳發(fā)酵時間為72?h。

3??討論

本研究前期通過苯酚-硫酸法從22株可產(chǎn)多糖膠質(zhì)的菌株中篩選獲得1株黃原膠的高產(chǎn)菌FJAT-10151，產(chǎn)量為8.65 g/L;通過16S rDNA序列的同源性分析鑒定為地毯草黃單胞菌^[7]。通過形態(tài)學觀察、生理生化實驗、革蘭氏染色法鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌株，菌落較小，圓形、淡黃色，表面光滑且濕潤、微隆，邊緣整齊、不透明，具有遷移性^[7]。本研究通過電鏡觀察研究菌株FJAT-10151分泌黃原膠的過程，菌株FJAT-?10151為短桿狀，端生鞭毛，菌體外面形成了厚厚的莢膜，黃原膠聚集或纏繞在細胞表面，且許多菌體通過黃原膠連在一起。

微生物的生長繁殖分為延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期^[21]，其中對延遲期和穩(wěn)定期的研究具有重要的實際應(yīng)用價值^[22]。菌株FJAT-10151的生長曲線未出現(xiàn)延遲期，說明菌株FJAT-10151適應(yīng)期短，環(huán)境適應(yīng)性較強;菌株FJAT-10151的生長曲線的穩(wěn)定期很長，穩(wěn)定期是菌體代謝產(chǎn)物大量積累的時間段，即該菌株能較長時間積累致病性原因之一的黃原膠^[5-6]，說明其致病力強^[23];菌株FJAT-10151的生長曲線沒有出現(xiàn)衰亡期，可能是因為菌株FJAT-10151分泌黃原膠而影響OD₆₀₀吸光度的測定，這與朱艷蕾^[22]研究的菌株AY9產(chǎn)紅色素而影響OD₆₀₀的吸光度一致，也未出現(xiàn)衰亡期。

菌株FJAT-10151在發(fā)酵后期黃原膠中丙酮酸的含量降低，根據(jù)Hsu等^[24]報道的黃原膠的代謝合成途徑分析，當菌體細胞中丙酮酸濃度隨著發(fā)酵時間逐漸增大，達到一定程度，由于底物抑制作用，就會有更多的丙酮酸基合成到黃原膠分子上。當發(fā)酵時間越長，發(fā)酵液中游離的丙酮酸含量越高，當達到一定濃度時，會導致發(fā)酵液pH下降，不利于黃原膠的合成，所以出現(xiàn)了黃原膠中丙酮酸含量降低的現(xiàn)象。為獲得高丙酮酸含量的黃原膠，趙潤寶等^[25]在發(fā)酵過程中添加游離的丙酮酸來提高所產(chǎn)的黃原膠分子中丙酮酸功能基團的含量。本研究中地毯草黃單胞菌FJAT-10151在發(fā)酵時間為72 h時，分泌的黃原膠中丙酮酸含量最高。莫曉燕等^[26]報道的黃原膠的最優(yōu)發(fā)酵時間也是72 h，張建國等^[27]報道的野油菜黃單胞菌產(chǎn)黃原膠的最優(yōu)發(fā)酵時間則是120 h。

黃原膠具有片狀和絲狀2種形態(tài)。黃原膠是由D-葡萄糖基主鏈及1個D-甘露糖和2個D-葡萄糖醛酸交替連接的側(cè)鏈組成，部分連接主鏈的甘露糖被乙?；糠帜┒说母事短沁B有丙酮酸，丙酮酸基團可相互之間形成氫鍵，也可與乙?；a(chǎn)生氫鍵。黃原膠分子是由無規(guī)則的線圈相互纏繞而形成的，當達到一定濃度時形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)^[28]。黃原膠分子中，與主鏈C₃相連的支鏈通過氫鍵、靜電作用等反向纏繞主鏈骨架，形成五重折疊的棒狀螺旋結(jié)構(gòu)^[29]，黃原膠分子間靠氫鍵形成雙股螺旋，雙股螺旋靠非共價鍵結(jié)合可排成整齊的“超級接合帶狀”的螺旋共聚體^[30]，當黃原膠濃度增大，黃原膠分子發(fā)生聚集，形成棒狀。

地毯草黃單胞菌因正向調(diào)控黃原膠的合成而致病^[31]。錢韋^[32]根據(jù)已釋放的基因組序列分析獲得地毯草黃單胞菌與野油菜黃單胞具有高度相似的密碼子使用模式。染色體的xps?Ⅲ、xps?Ⅳ、xps?Ⅵ區(qū)域和一個35.3?kb基因簇的基因編碼產(chǎn)物與合成黃原膠所需的前體糖核苷等衍生物的形成有關(guān)，xpsⅠ區(qū)域即gum基因簇基因產(chǎn)物與構(gòu)成黃原膠的五糖重復單元的順序性組裝、殘基修飾、重復單元間的聚合以及黃原膠的分泌有關(guān)^[33]。陸光濤等^[33]發(fā)現(xiàn)35.3?kb基因簇下的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶wxcA基因影響胞外多糖的分泌，可能是影響胞外多糖合成過程的某一糖基的反應(yīng)，也可能是因為影響細胞膜蛋白和分泌系統(tǒng)蛋白的正確組裝或是細胞信號傳導而影響胞外多糖的轉(zhuǎn)運和分泌。

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