王亞飛,宋長亮,張振軍,楊瓊,楊庚武,張磊,田云霄,宋小天
邯鄲市中心醫(yī)院1腫瘤科,3病理科,河北 邯鄲056000
2邯鄲市骨科醫(yī)院骨科,河北 邯鄲056000
4河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,石家莊0500170
肺癌是全球疾病致死的最主要原因,是一種侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng)的惡性腫瘤。大部分肺癌患者就診時(shí)已處于中晚期,5年生存率很低,預(yù)后效果極差,嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率約占肺癌的85%[2-3],是一種中度放療敏感的惡性腫瘤。隨著醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展,近幾年臨床上針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的放療取得了突出成績,放療已逐漸成為中晚期非小細(xì)胞肺癌治療的有效手段之一,但是由部分患者在治療的中后期出現(xiàn)抗輻射效應(yīng),放療效果并不理想。因此,如何提高放射敏感性備受學(xué)術(shù)界的關(guān)注。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類短小、非編碼RNA,在維持機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)、免疫應(yīng)答、生長發(fā)育和新陳代謝等過程中發(fā)揮重要的作用。大量的研究表明,miRNA能夠影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[4-6]。其中,關(guān)于miRNA-145的研究較多,其在多種腫瘤組織或細(xì)胞中低表達(dá),與腫瘤的增殖、凋亡等生理過程密切相關(guān)[7-8]。有研究報(bào)道,miRNA-145還能夠增強(qiáng)宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[9],但其在非小細(xì)胞肺癌中的作用及其對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的研究報(bào)道較少。本研究分析了miRNA-145在A549細(xì)胞中的表達(dá)情況,并探討了干擾其表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡的作用及其對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響。
人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素和胎牛血清均購于美國Hyclone公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒均購于美國Invitrogen公司。miRNA-145模擬物(miRNA-145 mimic)、miRNA-145陰性對(duì)照(control miRNA)質(zhì)粒、內(nèi)參U6引物和miRNA-145引物均購于廣州銳博生物科技技術(shù)有限公司。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連TaKaRa公司,總RNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)試劑和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)儀均購于美國BioRad公司。核酸濃度檢測儀(NanoDrop 2000c)購于美國Thermo Scientific公司。醫(yī)用加速器購于美國Varian公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出保存的BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞,迅速置于37℃水浴鍋中解凍復(fù)蘇后,接種到RPMI1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素)中,在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí),以0.25%胰蛋白酶消化,按1∶2傳代培養(yǎng)。
1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞,以105/ml細(xì)胞密度,每孔2 ml接種于6孔細(xì)胞板上,將其隨機(jī)分為miRNA-145組、NC組和對(duì)照組3組。次日,參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將終濃度為80 nmol/L的miRNA-145模擬物轉(zhuǎn)染至miRNA-145組細(xì)胞中,miRNA-145陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NC組細(xì)胞中,對(duì)照組細(xì)胞只加入轉(zhuǎn)染試劑。采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量以評(píng)價(jià)其轉(zhuǎn)染效果。
1.2.3 RT-PCR檢測miRNA-145表達(dá)情況 收集生長良好的BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞,以總RNA提取試劑盒提取總RNA,NanoDrop 2000c檢測RNA的純度和濃度。采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后,進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性300 (s1個(gè)循環(huán));95℃變性30 s,60℃退火30 s和72℃延伸120 s,共40個(gè)循環(huán);72℃總延伸360 s(1個(gè)循環(huán))。每組重復(fù)3次。內(nèi)參基因?yàn)閁6,采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量。1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 收集對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml后接種于96孔板上,于CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。次日,將其按照1.2.2中的步驟進(jìn)行分組與轉(zhuǎn)染,分別在處理24、48、72 h時(shí)收集各組細(xì)胞,加入MTT溶液,孵育4 h后,再加入二甲基亞砜,反應(yīng)20 min,采用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各組細(xì)胞的光密度(optical density,OD)值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 收集轉(zhuǎn)染48 h生長良好的對(duì)照組、NC組和miRNA-145組細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后制成濃度為105/ml的細(xì)胞懸液。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作,依次加入 Annexin V-FITC 5 μl和 PI 10 μl,振蕩混勻,37℃下避光培養(yǎng)15 min,通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測各組細(xì)胞的凋亡率。每組重復(fù)3次。
1.2.6 細(xì)胞放射敏感性檢測 收集生長良好的對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板上,隨機(jī)分為2組,以轉(zhuǎn)染miRNA-145模擬物的細(xì)胞為miRNA-145組,以未做處理的細(xì)胞為對(duì)照組。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后,兩種細(xì)胞均給予劑量為2、4、6、8 Gy的6MV X線進(jìn)行照射。照射條件:劑量率為100 cGy/min,照射源-皮距(source-skin distance,SSD)為100 cm。照射結(jié)束后,采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的放射敏感性。更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,以冷甲醇固定,姬姆薩溶液染色。在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù),以大于50個(gè)細(xì)胞為有效克隆。以單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線,經(jīng)GraphPad Prism 7軟件生成平均致死劑量(mean lethal dose,簡稱 D0)、準(zhǔn)域劑量(quasi-domain dose,Dq)、外推數(shù)(N)、2 Gy照射后的存活分?jǐn)?shù)(survival fraction at 2 Gy,SF2)和放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)等參數(shù)值。每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
RT-PCR檢測結(jié)果顯示,A549細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量為(0.08±0.03),明顯低于正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞的(1.02±0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.92,P<0.01)。將miRNA-145模擬物和miRNA-145陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后,miRNA-145組、NC組、對(duì)照組細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量分別為(13.53±1.25)、(0.95±0.08)、(1.03±0.06),3組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=300.01,P<0.01);NC組和對(duì)照組細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);miRNA-145組細(xì)胞中 miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.146,P<0.05)。
對(duì)照組、NC組、miRNA-145組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72 h的OD值比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同一作用時(shí)間點(diǎn),miRNA-145組細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t24h=2.887、t48h=4.070、t72h=3.203,P<0.05),而NC組與對(duì)照組細(xì)胞的OD值比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表1)
表1 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞OD值的比較
轉(zhuǎn)染48 h后,對(duì)照組、NC組和miRNA-145組細(xì)胞的凋亡率分別為(7.45±0.74)%、(8.26±0.82)%和(16.13±1.60)%,3組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.736,P<0.01);NC組與對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);miRNA-145組細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.471,P<0.05)。(圖1)
圖1 FCM法檢測A549細(xì)胞的凋亡情況
以2、4、6、8 Gy不同劑量的X線照射對(duì)照組和miRNA-145組細(xì)胞,根據(jù)打擊多靶模型擬合A549細(xì)胞的存活曲線,結(jié)果顯示,不同劑量的X線照射后miRNA-145組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(survival fraction,SF)均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 2)。miRNA-145組細(xì)胞的D0、Dq、N、SF2分別為1.439 Gy、1.292 Gy、2.454、0.505,對(duì)照組細(xì)胞的 D0、Dq、N、SF2分別為 2.146 Gy、2.262 Gy、2.869、0.762。上調(diào)miRNA-145表達(dá)后A549細(xì)胞的SER為1.491。
圖2 打擊多靶模型擬合 A549細(xì)胞的存活曲線
miRNA-145位于人類5q32染色體上,是一種高度保守的RNA,具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體,經(jīng)相關(guān)酶切后可形成由21個(gè)堿基組成的成熟miRNA-145[10-11]。miRNA-145在腫瘤組織或細(xì)胞中異常低表達(dá),其作為抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Lu等[12]的研究發(fā)現(xiàn),miRNA-145在腎癌組織中表達(dá)下調(diào),恢復(fù)其表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程明顯受到抑制,且細(xì)胞凋亡顯著增加。王寰昱等[13]的研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miRNA-145表達(dá)能有效抑制肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。近年來,有報(bào)道發(fā)現(xiàn)miRNA-145在非小細(xì)胞肺癌患者的組織和血清中低表達(dá),與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。但miRNA-145表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡關(guān)系的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn),與正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞比較,miRNA-145在A549細(xì)胞中低表達(dá);以脂質(zhì)體法上調(diào)其表達(dá)后,同一作用時(shí)間點(diǎn),miRNA-145組細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,細(xì)胞的增殖能力受到抑制;而轉(zhuǎn)染48 h后miRNA-145組細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組,細(xì)胞的凋亡能力增強(qiáng)。提示上調(diào)miRNA-145表達(dá)可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡來抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。
放療是非小細(xì)胞肺癌中晚期常用的一種治療方法,主要是通過放射線的輻射能量作用于DNA分子,引起DNA損傷,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而起到治療非小細(xì)胞肺癌的作用[15]。miRNA在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[16]。miRNA-145是miRNA中的重要一員,在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞放射敏感性方面發(fā)揮著重要的作用。Ye等[17]的研究結(jié)果顯示,miRNA-145在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低,過表達(dá)miRNA-145可通過靶向DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子,增強(qiáng)體內(nèi)和體外宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。同時(shí),Yan等[18]還發(fā)現(xiàn)miRNA-145可通過下調(diào)八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄 因 子 4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)的表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。Gong等[19]在前列腺癌小鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),異常高表達(dá)的miRNA-145可增強(qiáng)輻射對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。為了進(jìn)一步探討miRNA-145對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的放射敏感性,本研究以不同放射劑量照射A549細(xì)胞后,經(jīng)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),miRNA-145組細(xì)胞的 D0、Dq、N、SF2均低于對(duì)照組,上調(diào)miRNA-145表達(dá)后A549細(xì)胞的SER為1.491。結(jié)果提示,上調(diào)miRNA-145表達(dá)可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的輻射殺傷作用。
綜上所述,miRNA-145在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量較低,上調(diào)其表達(dá)能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。本研究結(jié)果豐富了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生機(jī)制,同時(shí)也為以miRNA-145為靶點(diǎn)的非小細(xì)胞肺癌放療的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。然而,miRNA-145調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展及放射敏感性的分子機(jī)制十分復(fù)雜,有待進(jìn)一步深入研究。