L-苯丙氨酸對蘋果醋發(fā)酵乙酸-2-苯乙酯合成途徑的影響

宋 娟，張霽紅，康三江*，張海燕，曾朝珍，袁 晶，張 芳，黃玉龍

（甘肅省農業(yè)科學院 農產品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘋果醋是以蘋果汁或渣作為原料，經過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵后獲得[1]，再加以調制成有獨特蘋果香氣的醋飲料[2-3]。由于蘋果品種差異、菌種老化、加工工藝單一等原因，導致追求蘋果醋制品多樣化的同時，卻引起果醋香氣等品質的下降。

L-苯丙氨酸是一種符合現代食品工業(yè)綠色安全標準的食品添加劑[4-5]，主要是微生物通過從頭合成途徑和艾氏途徑將L-苯丙氨酸轉化為β-苯乙醇[6]。許多發(fā)酵產品在發(fā)酵過程中由微生物自然形成具有風味和香氣的酯類化合物，大多數酵母菌能產生雜醇油，而β-苯乙醇是雜醇油的重要組成部分，具有玫瑰香味；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是醋酸發(fā)酵的關鍵酶，該酶是膜結合蛋白，與醋酸菌的膜結合影響醋酸菌的乙醇轉化率和醋酸菌的產酸率[7]；乙酸-2-苯乙酯是酵母菌發(fā)酵產品的主要的特征性香氣成分，具有甜蜜香味[8-9]，已有研究發(fā)現其合成途徑有兩條[10-12]：（1）在酯酶（esterase）的作用下由乙酸和β-苯乙醇合成；（2）在醇酰基轉移酶（alcohl acyltransferaes，AAT）的作用下由乙酰輔酶A和β-苯乙醇形成。目前，國內外學者主要采用不同處理方式如超聲[13]、微波[14]，調控氮源濃度[15]，不同特性的酵母菌種共發(fā)酵[16]，生物酶解技術[17]等方法提高乙酸苯乙酯等酯類物質的含量。在紅曲黃酒釀造中發(fā)現乙酸-2-苯乙酯是在后續(xù)發(fā)酵過程中酵母通過酯合成[18]，主要是酯酶合成途徑[19]；蘋果酒酵母代謝中乙酸苯乙酯主要由AAT催化合成[10]，且AAT對乙酸苯乙酯的合成具有特異性[20]，STRIBNY J等[21]也同樣提出葡萄酒釀造中AAT具有底物特異性。然而，在蘋果醋發(fā)酵過程中，L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其關鍵酶活的影響還未見相關研究。

本試驗在該課題前期研究[22-23]的基礎上，采用頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），初步分析食品添加劑L-苯丙氨酸對蘋果醋中合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質和關鍵酶活的影響，為蘋果醋制品香氣成分和風味物質的代謝調控提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蘋果（“長富二號”紅富士）：甘肅慶陽。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1750、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）CICC20056：中國工業(yè)微生物菌種中心。

1.1.2 培養(yǎng)基[24]

基礎培養(yǎng)基：10 g/L葡萄糖，10 g/L酵母粉，pH 4.5。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉。

轉化培養(yǎng)基：60g/L葡萄糖，6g/L蛋白胨，0.5g/LMgSO4，5 g/LKH2PO4，分別添加0、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的L-苯丙氨酸，自然pH值。上述培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

氫氧化鈉（粒）、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂、無水乙醇、碳酸鈣、MgSO4、KH2PO4（均為分析純及生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；果膠酶（＞50 000 U/g）：上海源聚生物科技有限公司；乙酸、乙醇、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-辛醇（色譜純）（67.396 mg/L）：美國Sigma公司；L-苯丙氨酸（98.5%）：上海生工生物公司股份有限公司；乙酰輔酶A/ADH/AAT/Esterase ELISA試劑盒：北京冬歌生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子天平：上海賽多利斯貿易有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；PZJ-0.5型榨汁機：江蘇科威機械有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；TRACE 1310-ISQ-LT氣相色譜-質譜聯用儀、三重四級桿氣質聯用儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；Synergy H1酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

吸取0.5 mL基礎培養(yǎng)基溶解菌粉，菌懸液轉移至盛有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，24℃（CICC1750）/28℃（CICC 20056）恒溫培養(yǎng)；劃線制備活化的酵母菌，按8%接種于轉化培養(yǎng)基，120 r/min、24 ℃培養(yǎng)48 h，備用。

1.3.2 蘋果醋加工工藝流程

富士蘋果→挑選、清洗、榨汁→蘋果汁、渣分離→果膠酶處理蘋果汁→接種酵母菌液（酒精發(fā)酵）→接種醋酸菌（醋酸發(fā)酵）→陳釀→蘋果醋

操作要點：采用0.8%果膠酶（酶活＞50000U/g）處理蘋果汁（降低果汁黏稠度，提高出汁率和澄清度）；接種8%CICC1750酵母菌液，24℃條件下酒精發(fā)酵，當酒精體積分數不增加、糖度不降低時結束酒精發(fā)酵；接種10%CICC20056醋酸菌液，28℃條件下醋酸發(fā)酵，當醋酸濃度不再升高時結束醋酸發(fā)酵。將醋酸發(fā)酵后的蘋果醋放入密閉容器中，控制溫度在18～25℃之間，靜置3個月以上完成陳釀過程。

1.3.3 測定方法

（1）揮發(fā)性物質的測定[25-26]

頂空固相微萃取法：樣品前處理采用SPME法處理，分別取5 mL樣品加入50 μL 3-辛醇內標，漩渦混勻，裝入15 mL頂空瓶中，樣品由TriPlus RSH Autosampler-SPME系統(tǒng)處理，萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。萃取條件：60.0℃吸附40 min。保溫5 min。外標標準品母液1 000 mg/L，100 mL純乙醇＋0.1 g外標（乙酸、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯），外標測試樣品準備A液10 mL（體積分數4%乙醇溶液）＋10 μL待測母液，樣品瓶5 mL＋50 μL 3-辛醇內標。

氣相色譜（GC）條件：進樣口溫度25℃，載氣氦氣（He），流速1.2 mL/min。進樣量1 μL，分流進樣，分流比40∶1。色譜柱為DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序40 ℃恒溫2min，以5℃/min升至180℃，然后從15℃/min升至230℃，5 min。

質譜（MS）條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度250℃。掃描范圍33.00～350.00 u。

（2）乙酰輔酶A、ADH、AAT、Esterase酶活性的測定[27]

采用ELISA試劑盒檢測樣品中的乙酰輔酶A、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、AAT、酯酶活性。酶標儀測定450 nm波長處各孔的OD450nm值，計算樣品濃度。

（3）酒精度[28]：以乙醇計，GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》，密度瓶法測定。

1.3.4 感官評價[29]

以不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋為基礎原料，加入蔗糖、蛋白糖、濃縮蘋果汁等，調配成蘋果醋飲料，經過均質、預熱、灌裝、密封，在95℃下保持10 min滅菌處理，冷卻得到成品，組織30名品評人員，按表1的內容分別從色澤、香氣、滋味和組織形態(tài)共四個方面進行評定并打分（滿分100分計）。

表1 蘋果醋飲料制品的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of apple vinegar beverages

1.3.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析、采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 L-苯丙氨酸對乙酸-2-苯乙酯合成途徑的影響

2.2.1 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯相關基質濃度的影響

L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質濃度的影響結果見圖1。由圖1可以看出，隨著L-苯丙氨酸添加量的增加，β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量均比對照樣（不添加L-苯丙氨酸）的高，說明L-苯丙氨酸有明顯的誘導乙酸-2-苯乙酯合成及其相關基質生成量積累的作用，具有劑量依賴性。和對照樣相比，當L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A、乙酸-2-苯乙酯的濃度均達到最大值，分別增加了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%。當L-苯丙氨酸添加量＞8g/L時，合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質生成量都出現下降的現象，可能是發(fā)酵過程中代謝物的高濃度蓄積，存在產物抑制效應，抑制了微生物生長，導致發(fā)酵代謝物產量下降。因此，初步將8 g/L作為L-苯丙氨酸的最佳添加濃度。該添加量條件下更有利于增加蘋果醋發(fā)酵中特征性香氣成分乙酸-2-苯乙酯的生物合成，對合成乙酸-2-苯乙酯的醇?；D移酶途徑和酯酶途徑均有一定的影響。

大多數研究表明，L-苯丙氨酸質量濃度為5～10 g/L時為最佳底物濃度范圍[30]，8 g/L L-苯丙氨酸最佳添加量，對β-苯乙醇轉化量的影響與牛明福等[24]的研究結果是一致的，而其對乙酸、乙酰輔酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量的影響還未見相關報道。

圖1 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質濃度的影響Fig.1 Effect of L-phenylalanine on the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester and its related matrix concentration

2.2.2 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶活性的影響

L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶活性的影響結果見圖2。由圖2可知，和對照樣（不添加L-苯丙氨酸）相比，隨著L-苯丙氨酸添加量的增加，ADH和AAT酶活性出現不同程度的增加，然而酯酶活性明顯降低。其中，隨著L-苯丙氨酸添加量的增加，蘋果醋發(fā)酵液的ADH酶活均比對照樣的高，說明L-苯丙氨酸對ADH酶活有明顯誘導作用，可以誘導酒精發(fā)酵產生的乙醇轉化為醋酸，L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，ADH酶活達到最大值，比對照樣提高30.98%（P＜0.05）；和對照樣相比，L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，AAT酶活達到最大值，而低濃度的L-苯丙氨酸對AAT酶活沒有明顯的誘導效果。因此，8 g/L的L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶ADH、AAT的酶活性均有一定的促進作用，推測L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，可以通過醇?；D移酶途徑促進乙酸-2-苯乙酯的合成，這與8 g/L的L-苯丙氨酸使得合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質（β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A）生成量的達到最大值的數據結果一致。但是，不同濃度的L-苯丙氨酸處理的蘋果醋發(fā)酵液中酯酶活均比對照樣的低（P＜0.05），說明L-苯丙氨酸對蘋果醋發(fā)酵液的酯酶活卻有一定的抑制作用，由于酯酶是可逆酶，可能是酯酶代謝途徑太長，支路太多，L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯的酯酶途徑影響的機理有待深入研究。

圖2 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶活性的影響Fig.2 Effects of L-phenylalanine on key enzymes activities in the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester

2.3 蘋果醋飲料感官評價

不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲品的感官評價結果見表2。從表2的感官評價結果可以看出，對不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品屬于中上等級，其中8 g/L的L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料感官評價最優(yōu)，具有較濃厚的香氣和風味。

表2 不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品的感官評價Table 2 Sensory evaluation of apple vinegar beverages treated with different L-phenylalanine addition

3 結論

在蘋果醋發(fā)酵過程中，初步發(fā)現食品添加劑L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質的生成量和關鍵酶活性有一定的影響。當L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A、乙酸-2-苯乙酯的質量濃度分別提高了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%，且不同添加量的L-苯丙氨酸有明顯誘導乙酸-2-苯乙酯合成及其相關基質生成量積累的作用，具有劑量依賴性；同時，L-苯丙氨酸可以誘導ADH將乙醇轉化為醋酸、催化β-苯乙醇和乙酰輔酶A通過醇?；D移酶途徑生成乙酸-2-苯乙酯，卻對酯酶活性有抑制作用，不利于乙酸-2-苯乙酯通過酯酶途徑進行生物合成。綜合考慮，初步推測將8 g/L作為L-苯丙氨酸的最佳添加量，通過醇酰基轉移酶途徑促進乙酸-2-苯乙酯的合成及其相關基質（β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A）的生成量和關鍵酶ADH、AAT的酶活性，經感官評價得出8 g/L L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品能較好的滿足消費者的需求，為高品質蘋果醋的技術研究和指導生產實踐提供一定的理論依據。