一株雞大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性研究

江林宜

（江蘇省連云港市灌南縣百祿動(dòng)物防疫檢疫所，灌南 223500）

雞大腸桿菌病在臨床上可單獨(dú)發(fā)生或與其他疾病混合感染，引起胚胎死亡、臍炎、敗血癥、輸卵管炎、滑膜炎、肉芽腫、卵黃性腹膜炎和眼炎等一系列病癥。病原體E.coli抗原性復(fù)雜，血清型多樣，雞感染后的臨床癥狀和病理變化多變[1]。

1894年Ligniers首次報(bào)道E.coli可引起禽類大批死亡。近年來，隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，集約化程度的不斷提高和雞新品種的增加，雞大腸桿菌病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，流行范圍逐漸擴(kuò)大，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害，已成為雞群重要的細(xì)菌性疾病之一[2]。在臨床治療中使用的大量抗菌藥物，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，形成惡性循環(huán)[3]。同時(shí)，抗菌藥物在畜禽體內(nèi)的殘留還給養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的身體健康帶來潛在危害[4]。調(diào)查雞大腸桿菌耐藥性現(xiàn)狀，對(duì)指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥是十分必要的[5]。

本研究對(duì)送檢的疑似大腸桿菌病例進(jìn)行了病原的分離鑒定，并對(duì)分離菌的培養(yǎng)特性、生化特性等進(jìn)行分析，為雞大腸桿菌病的診斷和防治提供依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 病料來源 樣品來自江蘇省灌南縣百祿鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站收集的1只發(fā)病雞。發(fā)病雞縮頭、垂翅，大便拉稀，病程5～6 d。

1.2 材料與試劑 生化管購自杭州微生物試劑有限公司；16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit購自寶生物工程（大連）有限公司； LB瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基均按通用的配制比例及使用說明自行配制，其中瓊脂粉和麥康凱購自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司；藥敏試驗(yàn)紙片為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌分離 采集發(fā)病雞的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官組織，無菌條件下在麥康凱瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，37℃溫箱培養(yǎng)24～48 h后，觀察結(jié)果。挑取典型菌株再接種于LB瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)菌的生長情況。

1.4 革蘭氏染色 用接種環(huán)挑取生理鹽水蘸于潔凈玻片上，再挑取適量的分離細(xì)菌純培養(yǎng)物與玻片上的生理鹽水混合，均勻涂布；自然干燥后用火焰固定，在玻片上滴加結(jié)晶紫染色液，1～3 min后水洗；加碘液媒染，1 min后水洗；加95%酒精脫色，15～30 s后水洗；最后加沙黃復(fù)染1 min后水洗，自然干燥后鏡檢，觀察細(xì)菌染色與形態(tài)。

1.5 生化試驗(yàn) 將分離菌株分別接種到含有下列培養(yǎng)基的生化管中：葡萄糖、棉子糖、乳糖、果糖、甘露糖、木糖、衛(wèi)茅醇、賴氨酸、鳥氨酸、阿拉伯糖、苯丙氨酸、H2S。接種后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，然后觀察生化管中培養(yǎng)基的變化情況。通過細(xì)菌微量生化管對(duì)所分離的菌株進(jìn)行生化指標(biāo)測定，初步判定細(xì)菌菌屬。生化試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考杭州微生物試劑有限公司生化管使用說明。

1.6 16S rDNA基因序列分析 根據(jù)GenBank中公布的大腸桿菌16S rDNA通用引物，選用 16S rDNA引物。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。預(yù)期擴(kuò)增出的目的片段大小為593 bp，引物均由上海杰李生物公司合成[7]。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer（含Mg2+20 mmol/L）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）0.5 μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5 μL，TaqDNA 聚合酶（1 U/μL）2.5 μL，大腸桿菌DNA 1.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72 ℃延伸1min30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4℃保存[8-9]。

1.7 藥敏試驗(yàn) 采用世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏紙片：氧氟沙星5 μg/片，氯霉素30 μg/片，青霉素10 μg/片，復(fù)方新諾明25 μg/片，恩諾沙星5 μg/片，卡那霉素30 μg/片，慶大霉素10 μg/片，諾氟沙星10μg/片，頭孢曲松鈉（菌必治）30 μg/片，萘啶酸30 μg/片，氟苯尼考30 μg/片，美洛西林75 μg/片，四環(huán)素30 μg/片，鏈霉素10 μg/片。挑取分離菌株，涂布到瓊脂平板，用無菌鑷子將藥敏紙片平貼于培養(yǎng)基表面，于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。藥敏試紙判定標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 病雞的大體病理變化 解剖發(fā)病雞發(fā)現(xiàn)，該病雞患有嚴(yán)重的肝周炎，肝臟腫大變硬，表面有纖維蛋白附著（圖1），同時(shí)患有心包炎、氣囊炎、腹膜炎。

2.2 細(xì)菌分離結(jié)果 發(fā)病雞器官組織在營養(yǎng)瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24 h后，形成中等大小，圓形微凸起，表面光滑濕潤，淺灰色半透明的菌落。在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小，表面光滑濕潤的粉紅色菌落（圖2）。革蘭氏染色為陰性桿菌，符合大腸桿菌的培養(yǎng)特性[10]。

圖1 病雞肝臟病變（A）及心臟病變（B）Fig.1 Pathological changes of liver(A) and heart(B) of the sick chicken

圖2 分離菌株在麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)Fig.2 Red colony on the Mac Conkey agar

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示分離菌能夠發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、棉子糖等大多數(shù)糖類，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，鳥氨酸和賴氨酸試驗(yàn)陽性，苯丙氨酸和硫化氫陰性。生化試驗(yàn)結(jié)果符合大腸桿菌特性（表1）。

表1 分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results of isolated strains

2.4 16S rDNA 基因序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，得到目的片段（圖4），然后將目的片段送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，最后將測定的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，16S rDNA 基因序列分析結(jié)果顯示分離菌為大腸桿菌[11-12]。

圖3 分離菌的PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection of isolated strain

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 本研究選擇了14種常用抗菌藥物對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[13]，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)菌必治、美洛西林、恩諾沙星、諾氟沙星的敏感性較高，而對(duì)萘啶酸、青霉素等耐藥（表2）。

表2 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug susceptibility test results of isolated strain

臨床治療應(yīng)避免盲目用藥，需在藥敏試驗(yàn)的指導(dǎo)下，選擇大腸桿菌高度敏感的藥物進(jìn)行有效治療[14]。治療雞大腸桿菌病應(yīng)找專業(yè)獸醫(yī)人員進(jìn)行診治，避免隨意亂用藥。根據(jù)日齡、病情輕重、采食狀況、用藥史等情況進(jìn)行綜合考慮，合理使用藥物，制定出最佳的治療方案，最好實(shí)行交替用藥和配合用藥[15]。