PCR結合核酸斑點雜交檢測豬偽狂犬病毒

烏那爾汗·吉斯汗，任衍倍，孟凡峰，田似報，符玉涓，張繼紅，李 舵，美熱木古麗，任 娟 ，林漢亮 ，崔治中 ,3,4，常 爽 ,3,4，趙 鵬 ,3,4

（1.新疆動物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊 830000；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018；3.山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，泰安 271018；4.山東省畜禽疫病防制工程技術研究中心，泰安 271018）

豬偽狂犬病（Porcine pseudorabies，PR）是由豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）感染引起的一種高度接觸性、急性傳染病[1]。PRV最早于1813年在美國被發(fā)現(xiàn)[2]。豬是PRV的原發(fā)貯存宿主，能夠長期貯存和排出病毒，在PR的傳播中起著重要的作用[3]。豬偽狂犬病臨床癥狀為發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎，能夠引起妊娠母豬繁殖障礙，流產(chǎn)，產(chǎn)死胎等；新生仔豬會出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉、嘔吐、生長不良等，死亡率很高[4]。

PRV基因組為線性雙股DNA，大小約150 kb，G+C含量高達73%[5-6]。gE基因是重要的毒力基因，對于病毒在宿主神經(jīng)系統(tǒng)中的侵襲和擴散起著決定性作用[7]。gE基因的缺失會降低 PRV在神經(jīng)系統(tǒng)中的感染和擴散，并且會提高動物的耐受性，使用時比較安全[8]。同時gE基因缺失對于病毒的復制和中和抗體的產(chǎn)生影響不大。因此，gE基因缺失苗在世界各國應用非常廣泛[9]。

近年來，豬偽狂犬病在各個地區(qū)普遍流行，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[10-12]。20世紀70年代以后，應用基因工程缺失疫苗和人工篩選的自然弱毒疫苗，使PR得到了有效地控制[13]。當前 PR防控主要依靠疫苗免疫，現(xiàn)有疫苗雖然能夠減輕臨床癥狀并減少排毒，但并不能預防潛伏感染。2011年PRV變異毒株的出現(xiàn)使豬PR在全國范圍內再次流行[14]。因此，控制感染豬群并清除潛伏感染豬群等手段被廣泛應用于 PR 防控。PR在臨床癥狀上容易與一些其他疾病混淆，僅通過臨床癥狀和病理剖檢很難做出準確診斷，因此實驗室診斷是PRV的重要診斷方法。PRV實驗室診斷主要通過病毒的分離鑒定、PCR及血清學試驗等方法。血清學診斷方法包括酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）和間接免疫熒光檢測（indirect immunofluorescence assay，IFA）等[15-18]。血清學診斷對試驗儀器要求較高，PCR檢測往往存在假陽性或假陰性，一般需要通過測序進一步驗證，而病毒分離檢測時間過長。因此，建立一種快速、簡便、靈敏度高、特異性強的可以鑒別診斷PRV野毒和gE基因缺失疫苗毒的檢測方法，對PRV的防制和凈化具有重要意義。本研究針對PRV的gE基因設計探針，建立了基于gE基因的PCR結合核酸斑點雜交檢測方法，為該病的診斷和流行病學調查提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 病毒與病料 豬偽狂犬病毒SDTA2016株由本實驗室分離鑒定和保存；在山東省不同豬場隨機采集53份豬病料，研磨后按照天根DNA提取試劑盒操作說明書提取病料DNA，－80℃保存。

1.2 PRV探針的設計及制備 根據(jù)NCBI上已經(jīng)發(fā)表的PRV的gE基因核酸序列，分別設計和合成了兩對引物。以SDTA2016毒株的DNA為模板，用引物PRV-F2/PRV-R2（表1）擴增，構建重組質粒，命名為PRV-gE。以質粒PRV-gE為模板，利用引物PRV-F1/PRV-R1（表1），按照PCR DIG Probe Synthesis Kit（Roche，USA）試劑盒說明書標記PRV的gE基因DIG標記核酸探針。標記的gE基因核酸探針經(jīng)凝膠回收純化后進行定量，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r引物PRV-F2/PRV-R2也用于樣品組織DNA的常規(guī)PCR檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 PCR結合核酸斑點雜交檢測 首先利用引物PRV-F2/PRV-R2對待檢測樣品的DNA進行擴增，對反應體系以及反應條件進行優(yōu)化，確定最佳PCR反應體系（50 μL）：2×GC Buffer25 μL、dNTP4 μL、引物PRV-F2/PRV-R2各0.5 μL、模板1 μL、PrimeSTAR酶0.5 μL，ddH20補足50 μL。最佳反應條件：95℃預變性5 min；98℃變性10 s，60℃退火5 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸5 min。取2 μL PCR擴增產(chǎn)物點于尼龍膜上，按照DIG Nucleic Acid Detection Kit說明書并參照文獻進行核酸斑點雜交檢測[19]。

1.4 PCR結合核酸斑點雜交檢測的特異性和靈敏性 對豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的cDNA以及豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）和PRV gE基因缺失疫苗株的DNA，運用建立的PCR結合核酸斑點雜交方法進行檢測，檢測該方法的特異性。將質粒PRV-gE進行定量后作倍比稀釋，濃度分別為100 ng/μL～1 pg/μL，稀釋的質粒作為模板，分別采用PCR和PCR結合核酸斑點雜交方法進行檢測，比較這兩種方法的靈敏性。最后，分別運用PCR和PCR結合核酸斑點雜交方法檢測53份臨床樣品的DNA。

2 結果與討論

2.1 PCR結合核酸斑點雜交特異性 用建立的PCR結合斑點雜交檢測方法，對SDTA2016毒株、PRV gE基因缺失疫苗株、PCV2、CSFV、PEDV、PRRSV的PCR產(chǎn)物進行檢測，并以滅菌的超純水作為陰性對照。結果DIG標記的PRV gE基因探針，只與SDTA2016毒株的PCR產(chǎn)物反應呈陽性，而與PRV疫苗株和其他幾種病毒的PCR產(chǎn)物以及超純水反應均不顯色（圖1），顯示出該方法具有較好的特異性。

圖1 PCR結合斑點雜交檢測豬偽狂犬病病毒的特異性試驗Fig.1 Specifi city results of PCR-based dot blot hybridization technique for PRV

2.2 PCR結合核酸斑點雜交檢測的靈敏性 運用建立的PCR結合核酸斑點雜交檢測方法，對各稀釋梯度的PRV-gE質粒進行雜交。PCR結合核酸斑點雜交檢測顯色到第5個梯度，并隨著濃度遞減顏色逐漸變淡，最低檢出量為10 pg/μL（圖2A）。運用PCR方法對各質粒進行檢測，僅能檢測到1 ng/μL（圖2B），明顯低于PCR結合核酸斑點雜交檢測的靈敏度。

圖2 PCR結合斑點雜交檢測和普通PCR的靈敏性比較Fig.2 Sensitivity comparison of PCR-based dot blothybridization technique and normal PCR

2.3 PCR結合核酸斑點雜交檢測在臨床樣品檢測中的應用 應用引物PRV-F2/PRV-R2對53份病料先進行PCR擴增，電泳結果顯示共有4份病料呈PRV陽性，陽性率為7.55%（圖3A）。將PCR擴增產(chǎn)物點于尼龍膜上進行核酸斑點雜交檢測，可見有5份樣品顯示陽性，比單純PCR檢出率高（圖3B）。

本研究建立的PCR結合核酸斑點雜交檢測的方法，可在一張尼龍膜上一次性檢測大量的樣本，操作簡單，探針特異性好并可重復使用，對儀器設備要求比較低，并且相對于傳統(tǒng)PCR和病毒分離鑒定等方法，靈敏性高，特異性強，用時較短。運用建立的PCR結合核酸斑點雜交檢測方法對山東省部分地區(qū)收集到的53份病料進行檢測，共檢出5份陽性，檢出率為9.43%，說明PRV在山東省仍有一定流行。

圖3 臨床樣品的PCR檢測和PCR結合核酸斑點雜交檢測結果Fig.3 PCR and PCR-based dot blot hybridization detection result for clinical samples

從最初自然缺失gE基因的Bartha株到gE/TK基因雙缺失及gI/gE/TK基因三缺失等疫苗株的出現(xiàn)，相對應的鑒別診斷方法一直在不斷改變。利用分子生物學方法對PRV進行病原學檢測，對于評價臨床感染情況有著重要意義，可為獸醫(yī)臨床制定合理的免疫程序和凈化程序提供重要參考。本研究建立的PCR結合核酸斑點雜交檢測方法不僅顯示了較高的靈敏度，更重要的是通過探針的嚴格把關確保了檢測的特異性，節(jié)省了測序的時間，將在PRV的鑒別診斷和凈化中發(fā)揮重要作用。