p38 MAPK阻滯劑對(duì)百草枯中毒急性肺損傷中TNF-α的影響

周志兵 張劍鋒（通訊作者） 向?yàn)r 李霽 羅毅豐

（廣西壯族自治區(qū)廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科 廣西 南寧 530007）

百草枯（paraquat poisoning，PQ）是民間常用的廉價(jià)除草劑，除草效果好而被廣泛應(yīng)用，因此也成為了急診病人常見的中毒原因之一[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，PQ中毒的病人早期即可發(fā)現(xiàn)肺組織的彌漫性炎癥反應(yīng)，以急性肺損傷病理變現(xiàn)為主，出現(xiàn)上皮細(xì)胞損傷，肺泡內(nèi)的水腫和出血，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，晚期導(dǎo)致以肺損傷為主的多器官功能障礙綜合征[2]。百草枯中毒救治成功率低，致死率高達(dá)60%～90%。目前關(guān)于百草枯中毒的機(jī)制尚不明確，研究表明炎癥反應(yīng)失衡以及氧化應(yīng)激是百草枯中毒的重要機(jī)制，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子TNF-α作為重要的炎癥介質(zhì)在百草枯中毒大鼠中是增高的[3]。p38屬于MAPK家族中的一員，它作為上游的環(huán)境壓力應(yīng)激反應(yīng)蛋白而能影響TNF-α的表達(dá)，關(guān)于p38 MAPK阻滯劑在百草枯中毒急性肺損傷大鼠中對(duì)TNF-α的影響的報(bào)導(dǎo)罕見，本研究將以百草枯灌胃來制作百草枯中毒急性肺損傷大鼠模型，應(yīng)用p38 MAPK阻滯劑SB203580干預(yù)后，觀察肺組織中TNF-α的變化。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體重200～250g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證：SYXK桂2014-0003。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，自由進(jìn)水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑、藥品和儀器

二氯百草枯結(jié)晶體（Sigma公司，美國），p38 MAPK阻滯劑SB203580，RNA保存液，RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司，ELISA 試劑盒購于華美公司，目的基因引物序列設(shè)計(jì)合成由南寧科迪公司完成。目的基因堿基序列：β-actin上游引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；TNF-α上游引物5'-GGCGTGTTCATCCGTTCTC-3'，下游引物為5'-CTTCAGCGTCTCGTGTGTTTCT-3'；p38MAPK 上 游引 物5'-GTGTCGGTGATGTCAGATGG-3'，下游引物：5'-CAGTATGCAGTCCAGCTCCA-3'。病理圖像分析系統(tǒng)（Leica公司，德國）。

1.3 方法

1.3.1 模型制作與分組 將36只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分成3組，其中生理鹽水對(duì)照組（NS組）12只，百草枯模型組（PQ組）12只，p38 MAPK阻滯劑干預(yù)組（PQ＋SB組）12只。PQ組和PQ＋SB組均給予100mg/kg的百草枯一次性灌胃；NS組給予大鼠與百草枯等量的生理鹽水灌胃。p38 MAPK阻滯劑組在灌胃后立即給予10mg/kg/天SB203580腹腔注射，并每24h重復(fù)給予SB203580一次，分別于灌胃后1d、3d后處死并留取標(biāo)本，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 第 1、3天各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相對(duì)表達(dá)比較（±s）

表1 第 1、3天各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相對(duì)表達(dá)比較（±s）

注：與NS組第1天相比，①P＜0.05，⑤P＜0.05；與NS組第3天相比，②P＜0.05，⑥P＜0.05；與PQ組第1天相比，③P＜0.05，⑦P＜0.05；與PQ組第3天相比，④P＜0.05，⑧P＜0.05；在PQ組內(nèi)第1天與第3天相比，⑨P＜0.05；在PQ+SB組內(nèi)第1天與第3天相比，⑩P＞0.05；在PQ組內(nèi)第1天與第3天相比，?P＜0.05；在PQ+SB組內(nèi)第1天與第3天相比，?P＜0.05。

TNF-α p38 MAPK PQ組 PQ+SB組 PQ組 PQ+SB組NS組 第1天 1.954812±0.335586① - 2.199330±0.195087⑤ -第3天 4.111881±0.997487② - 3.475220±0.431125⑥ -PQ組 第1天 - 0.190781±0.030778③ - 0.534773±0.014130⑦第3天 2.109590±0.422647⑨ 0.062689±0.034125④ 1.577948±0.083984? 0.169343±0.016417⑧PQ+SB組 第1天 - - - -第3天 - 0.878399±0.454120⑩ - 0.500709±0.065733?

1.3.2 標(biāo)本采集 10%水合氯醛以0.03ml/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動(dòng)脈放血處死，剖開頸部皮膚暴露氣管，同時(shí)開胸暴露心肺及大血管，結(jié)扎左側(cè)肺門以后使用10ml注射器吸取PBS緩沖液扎入右心室從而灌注沖洗肺中血液。取以下樣本：①結(jié)扎左主支氣管，行支氣管肺泡灌洗（BALF），收集灌洗液于2000rpm離心15min，留取上清，并分裝入 1.5ml EP管內(nèi)置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。②取右下肺用RNA保存液畳于-20℃攝氏度冰箱保存?zhèn)溆?，待做Real-time PCR檢測(cè)，余下肺保存?zhèn)溆茫?、左肺10%甲醛固定48h，后續(xù)病理檢測(cè)。

1.3.3 標(biāo)本病理染色檢測(cè) 取48h固定后的左肺，脫水、浸蠟、包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)，使用光學(xué)顯微鏡對(duì)肺組織的病理變化進(jìn)行觀察。

1.3.4 取肺泡灌洗液 按TNF-a的Elisa試劑盒說明書操作，測(cè)得OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出濃度。

1.3.5 各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的檢測(cè)采用qRT-PCR 法 使用RNA提取試劑盒對(duì)肺組織總RNA進(jìn)行提取，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄 RNA 成cDNA。內(nèi)參選用β-actin，選擇20μL體系進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。用2-△△CT表示受檢組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

實(shí)驗(yàn)開始后，NS組大鼠進(jìn)食正常，毛發(fā)順白，精神狀態(tài)尚好，行動(dòng)自如。PQ組大鼠進(jìn)食、飲水量較NS組減少，毛發(fā)粗糙、稀疏，精神疲、行動(dòng)緩慢，易激惹，口唇及鼻部偶見血性分泌物。PQ＋SB組大鼠可見與PQ組類似的中毒癥狀，但癥狀較PQ組輕。

2.1 肺組織病理學(xué)改變 NS組的大鼠肺大體觀呈均勻粉紅色，包膜光滑、柔軟、彈性好；光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁薄，間質(zhì)血管無擴(kuò)張，支氣管黏膜上皮完整。PQ組的大鼠未灌洗之前肺大體觀可見組織腫脹，色不均勻，表面可見大面積出血點(diǎn)；光鏡下組織內(nèi)可見較多肺泡萎陷，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，伴灶性肺泡內(nèi)出血，部分肺泡腔內(nèi)有水腫液，肺內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔不同程度增寬。PQ＋SB組的大鼠肺組織病變輕于染毒組，肺泡內(nèi)出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺間質(zhì)水腫程度減輕。見圖。

圖 大鼠肺組織病理學(xué)變化

2.2 各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達(dá)比較

PQ組大鼠在第1、3天肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達(dá)量均高于相同時(shí)間點(diǎn)NS組（P均＜0.05）；PQ＋SB組第1、3天大鼠肺組織中則表達(dá)量明顯低于相同時(shí)間點(diǎn)PQ組（P均＜0.05）。PQ組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PQ+SB組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠肺組織中TNF-α mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平比較

PQ組在第1、3天大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平與NS組相比有明顯差異（P＜0.05）；PQ＋SB組第1天大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平與PQ組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在第3天則明顯低于PQ組（P＜0.05）。PQ組和PQ＋SB組同一組內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠肺泡灌洗液TNF-α蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表2

表2 第 1、3天各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α蛋白的表達(dá)比較(ng/ml,±s)

表2 第 1、3天各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α蛋白的表達(dá)比較(ng/ml,±s)

注：與NS組第1天相比，①P＜0.05；與NS組第3天相比，②P＜0.05；與PQ組第1天相比，③P＞0.05；與PQ組第3天相比，④P＜0.05。

組別 TNF-α第1天 第3天PQ組 0.221268±0.042217① 0.265178±0.011183②SB組 0.194063±0.015772③ 0.152062±0.022503④NS組 0.021573±0.011077 0.029496±0.005304

3.討論

百草枯病人存活率低，尚未有良好的治療方法。病人食入后由于無法及時(shí)洗胃常常已經(jīng)吸收，而百草枯早期可與胺類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)肺泡Ⅱ型細(xì)胞的能量依賴性多胺攝取途徑而選擇性地在肺內(nèi)聚集[4]。這種攝取系統(tǒng)主要存在于肺泡Ⅱ型細(xì)胞，同時(shí)也存在于氣管Clara細(xì)胞和肺泡Ⅰ型細(xì)胞[5]。因此早期發(fā)現(xiàn)病人時(shí)百草枯往往已經(jīng)在肺中積累較高濃度，而目前研究發(fā)現(xiàn)的百草枯中毒機(jī)制包括了氧自由基損傷、氧化應(yīng)激損傷、胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、炎癥反應(yīng)失衡、線粒體損傷、DNA 損傷與細(xì)胞凋亡等[6]。眾多研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在百草枯中毒的病理發(fā)展進(jìn)程中起重要作用，Yang S等[7]提出PQ中毒早期有大量炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，其能分泌多種炎性介質(zhì)，而炎性介質(zhì)再反過來促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。

p38 MAPK屬于MAPK家族中的一員，是一條極其重要的環(huán)境壓力應(yīng)激反應(yīng)通路。p38 MAPK最初被認(rèn)為是LPS刺激的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到的一種酪氨酸磷酸化蛋白，對(duì)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有重要作用，是亞砷酸鹽、熱休克或白介素-1刺激的細(xì)胞中MAPK活化蛋白激酶2（MK2）的上游激活激酶[8]。廣泛的研究表明，p38 MAPK在許多不同的組織中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。而Wang,X[10]等發(fā)現(xiàn)在百草枯中毒急性腎損傷中p38 MAPK的磷酸化是增加的。TNF-α則主要由淋巴細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌。參于了機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫過程，是介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用百草枯灌胃法，以100mg/kg的劑量來構(gòu)建大鼠急性肺損傷模型，病理形態(tài)學(xué)上可見PQ組明顯較同一時(shí)間點(diǎn)的NS組炎癥明顯，肺組織損傷加重，這與課題組前期構(gòu)建的百草枯中毒急性肺損傷模型病理表現(xiàn)相同[12]。而應(yīng)用了p38 MAPK阻滯劑后，則改善了PQ所致的肺組織的損傷。SB203580是一種被應(yīng)用廣泛的高效p38 MAPK阻滯劑，Chen X[13-14]等人用該阻滯劑制作了相關(guān)模型，發(fā)現(xiàn)成功降低了p38的磷酸化。通過本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)肺組織中的TNF-α和p38 MAPK mRNA表達(dá)在PQ組的表達(dá)均高于同一時(shí)間點(diǎn)的NS組，而應(yīng)用阻滯劑后在同樣時(shí)間點(diǎn)則明顯降低了TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達(dá)。但是同一組內(nèi),只有PQ組TNF-αmRNA隨時(shí)間增加而增高，PQ+SB組無明顯差異。這可能是由于p38阻滯劑作用于百草枯中毒的大鼠后，對(duì)TNF-αmRNA干預(yù)的降低速率在三天內(nèi)較慢。檢測(cè)肺泡灌洗液中的TNF-α蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，PQ組不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于NS組，而應(yīng)用阻滯劑后在第1天無明顯差異，在第三天則能降低TNF-α蛋白表達(dá)水平。PQ+SB組也未能表現(xiàn)出TNF-α蛋白水平的時(shí)間依賴性減低。說明在p38 MAPK阻滯劑干預(yù)后，百草枯中毒肺組織中的炎癥介質(zhì)TNF-α蛋白表達(dá)水平在第一天的影響不明顯，而在第三天可以見到明顯的降低。由p38 MAPK的直接作用底物可知[15]，TNF-α本身不是p38 MAPK的直接作用底物，而是經(jīng)過中間相關(guān)分子后影響TNF-α的表達(dá)。YU[16]等做的模型中認(rèn)為p38 MAPK能影響核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的磷酸化，而NF-κB能影響TNF-α的轉(zhuǎn)錄。因此可解釋其在一天內(nèi)的影響并不明顯。

綜上，百草枯致急性肺損傷時(shí)，p38 MAPK阻滯劑可以抑制肺組織中TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)，改善肺組織的炎癥反應(yīng)，從而減輕肺損傷，這提示了在百草枯中毒急性肺損傷過程中，p38 MAPK可以通過影響TNF-α的表達(dá)，從而影響肺損傷時(shí)的肺組織炎癥反應(yīng)。