泛素E3連接酶TRIM10在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用及機(jī)制

劉 洋 陳東 侯翠柳 來松 楊 慧 肖雪 王筱筱 田 翠 王紅霞

缺血性心臟病是世界范圍的最主要死因［1］，而再灌注損傷是缺血性心臟病發(fā)生最主要的原因，如何保護(hù)心臟對抗再灌注損傷對心臟病學(xué)家來說是一種挑戰(zhàn)。心肌缺血-再灌注損傷是指心肌組織在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷沒有減輕反而加重甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象。雖然心肌缺血-再灌注的機(jī)制尚未完全被闡明，目前的研究認(rèn)為心肌細(xì)胞的凋亡為再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的一個重要環(huán)節(jié)［2］。細(xì)胞凋亡是指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程［3］。研究已證實凋亡可以由特異的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）來調(diào)控，其介導(dǎo)的凋亡在心力衰竭、缺血-再灌注損傷等心血管疾病中，起著關(guān)鍵性作用［4-5］。

UPS系統(tǒng)由泛素、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素-蛋白連接酶E3、26S蛋白酶體和去泛素化酶等組成［6］。真核生物體內(nèi)，80%～90%的蛋白被UPS系統(tǒng)特異性識別降解。UPS不僅是蛋白質(zhì)降解的重要機(jī)制，還參與炎癥、細(xì)胞增殖與分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、受體胞吞、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等重要生命過程的調(diào)節(jié)［7-8］。其中，泛素E3連接酶（如CHIP、MDM2等）負(fù)責(zé)特異性識別底物蛋白，參與心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生。

TRIM家族是一個近年來發(fā)現(xiàn)并且受到重視的含RING結(jié)構(gòu)域的E3連接酶。目前發(fā)現(xiàn)的TRIM家族蛋白有60多種［9］，參與調(diào)控凋亡、細(xì)胞周期、分化、細(xì)胞對病毒的反應(yīng)等諸多重要的生命過程。例如MID1基因的突變會導(dǎo)致先天性的Opitz綜合征［10］、TRIM25可誘導(dǎo)視黃酸誘導(dǎo)型基因-I的泛素化，對引發(fā)宿主抗病毒先天免疫至關(guān)重要［11］；TRIM59可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程促進(jìn)前列腺癌的細(xì)胞增殖等［12］。TRIM10是TRIM家族的成員之一，同樣具有E3連接酶的功能，主要參與紅系細(xì)胞的終末分化，對造血功能、細(xì)胞凋亡均具有重要的調(diào)節(jié)作用［13］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)TRIM10參與了心肌肥大的發(fā)生［14］，但是TRIM10在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用尚不清楚。

本實驗在原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siRNATRIM10敲低和轉(zhuǎn)染Ad-TRIM10過表達(dá)TRIM10，復(fù)制心肌細(xì)胞H/R模型（缺氧30 min，復(fù)氧24 h），觀察心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及相應(yīng)蛋白表達(dá)的情況，探討TRIM10在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用及其機(jī)制。

材料與方法

1.實驗動物 SD大鼠，新生乳鼠（出生24 h之內(nèi)）由北京維通利華有限公司提供。所有研究工作均遵守美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstitutesof-Health，NIH）制定的《實驗動物管理及使用指南》并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)。

2.主要試劑及儀器 TUNEL、DHE染色試劑盒購自瑞士Roche公司；過表達(dá)腺病毒Ad-TRIM10和Ad-GFP由漢恒生物公司合成；siRNA-TRIM10、siRNA-Scramble由中原生物有限公司合成。Lipofectamine 2000購自Invitrogen；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；TRIM10、GAPDH、BAX、p-JNK/JNK、p-P38/P38、p-ERK/ERK抗體及兔源II抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

3.主要方法 （1）原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:提取SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，放入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)24 h，饑餓6～8 h后，轉(zhuǎn) 染Ad-TRIM10和Ad-GFP（50 nmol/L，1∶1 000）過表達(dá)內(nèi)源性TRIM10或用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn) 染siRNA-TRIM10和siRNA-Scramble（20 nmol/L，1∶1 000）敲低內(nèi)源性TRIM10表達(dá)。48 h后，給予缺血Buffer處理30 min，再將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有ITS、CDlipid及10%BSA無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h收取細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

（2）細(xì)胞TUNEL染色 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS洗3 min，3次，0.1%Tritonx-100室溫封閉通透15 min，PBS洗3 min，3次，加入羅氏TUNEL染色試劑，37℃避光孵育60 min，PBS洗3 min，3次，抗熒光淬滅劑封片。用Nikon Labophot 2顯微鏡進(jìn)行采圖（×200），選擇6～8個視野，應(yīng)用Image J軟件統(tǒng)計每個視野細(xì)胞核數(shù)目及凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比值即為凋亡百分?jǐn)?shù)。

（3）細(xì)胞DHE染色 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS洗3 min，3次，室溫封閉通透15 min，PBS洗3 min，3次，DHE工作液滴染，37℃避光孵育30 min，PBS洗3 min，3次，抗熒光淬滅劑封片。用Nikon Labophot 2顯微鏡進(jìn)行采圖（×200），選擇6～8個視野，應(yīng)用Image J軟件統(tǒng)計每個視野細(xì)胞核數(shù)目及發(fā)生氧化應(yīng)激的細(xì)胞數(shù)，氧化應(yīng)激細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比值即為氧化應(yīng)激百分?jǐn)?shù)。

（4）Western blot實驗 用蛋白RIPA（PMSF∶RIPA=1∶100）裂解液120μL冰上裂解細(xì)胞15 min，用細(xì)胞刮刀收取至1.5 mL EP管中，細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞后離心（4℃、12 000 r/min）10 min，吸取上清，BCA法測蛋白濃度，取40～50μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，I抗4℃孵育過夜，次日洗滌10 min，3次。用II抗孵育膜1 h，洗滌15 min，4次，ECL顯影。

4統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析使用SPSS19.0軟件進(jìn)行。每個指標(biāo)進(jìn)行3次以上獨立重復(fù)實驗，所得計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，均數(shù)組間比較采用單因素方差分析方法.以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.H/R處理上調(diào)心肌細(xì)胞TRIM10蛋白表達(dá)H/R處理對TRIM10蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示:與對照組相比，H/R處理后6 h或24 h上調(diào)心肌細(xì)胞中TRIM10蛋白的表達(dá)，且在24 h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

2.敲低TRIM10減輕H/R誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生、而其過表達(dá)則加重以上變化 首先我們檢測siRNATRIM10和Ad-TRIM10轉(zhuǎn)染的效率，結(jié)果顯示:siRNA-TRIM10明顯下調(diào)TRIM10的表達(dá)（下降了60%，圖2 A），而Ad-TRIM10轉(zhuǎn)染效率為90%（圖2B）；進(jìn)一步觀察敲低或過表達(dá)TRIM10對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低TRIM10明顯減少H/R誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生（圖2C），而過表達(dá)TRIM10進(jìn)一步增加H/R誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生（圖2D）。

3.敲低TRIM10減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并下調(diào)BAX蛋白的表達(dá)、而其過表達(dá)則加重以上變化 與Control組相比，H/R明顯增加TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)，敲低TRIM10減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖3 A）；而過表達(dá)TRIM10則加重H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖3C）。進(jìn)一步我們檢測了促凋亡蛋白BAX的表達(dá)，結(jié)果顯示:與Control組相比，H/R組明顯上調(diào)心肌細(xì)胞BAX蛋白的表達(dá)，敲低TRIM10下調(diào)H/R誘導(dǎo)的BAX蛋白表達(dá)（圖3B）、而過表達(dá)TRIM10則加重了以上變化（圖3D）。

4.敲低TRIM10減輕H/R處理誘導(dǎo)的JNK和P38MAPK蛋白的磷酸化水平，而對ERK蛋白的磷酸化水平無影響 與Control組相比，H/R明顯增加JNK、P38MAPK、ERK蛋白的磷酸化；而敲低TRIM10減輕H/R誘導(dǎo)的P38MAPK、JNK蛋白的磷酸化，而對ERK的磷酸化水平無影響（圖4）。

5.過表達(dá)TRIM10增加H/R處理誘導(dǎo)的JNK和P38MAPK蛋白的磷酸化水平，而對ERK蛋白的磷酸化水平無影響 與Control組相比，H/R明顯增加JNK、P38MAPK、ERK蛋白的磷酸化；而過表達(dá)TRIM10增加H/R誘導(dǎo)的JNK、P38MAPK蛋白的磷酸化，而對ERK的磷酸化水平無影響（圖5）。

討 論

圖1 原代SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞不同時間培養(yǎng)后TRIM10蛋白的表達(dá)（n=5）

圖2 敲低或過表達(dá)TRIM10對H/R誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的影響 A:原代SD鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h TRIM10蛋白的表達(dá)，B:原代SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡觀察綠色細(xì)胞陽性數(shù)， C-D:DHE染色檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激情況（n=5）。注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

本實驗研究發(fā)現(xiàn)缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷增加心肌細(xì)胞中TRIM10蛋白的表達(dá)，提示TRIM10參與心肌缺氧/復(fù)氧損傷的發(fā)生。敲低TRIM10減輕H/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并下調(diào)BAX蛋白的表達(dá)。而過表達(dá)TRIM10，加重H/R誘導(dǎo)以上的改變。進(jìn)一步我們又探討了TRIM10參與以上作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)敲低TRIM10明顯降低了H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中p-JNK和p-P38MAPK的水平，而對p-ERK的表達(dá)無影響，提示TRIM10可能通過激活JNK/P38MAPK通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生進(jìn)而加重心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。

圖3 敲低或過表達(dá)TRIM10對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 A:TUNEL染色檢測敲低TRIM10對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響（n=5），B:WB檢測敲低TRIM10對H/R誘導(dǎo)的促凋亡蛋白BAX表達(dá)的影響（n=5），C:TUNEL染色檢測過表達(dá)TRIM10對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響（n=5），D:WB檢測過表達(dá)TRIM10對H/R誘導(dǎo)的促凋亡蛋白BAX表達(dá)的影響（n=5）。注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

圖4 敲低TRIM10對H/R誘導(dǎo)的JNK、P38MAPK、ERK蛋白磷酸化水平的影響（n=5） 注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

圖5 過表達(dá)TRIM10對H/R誘導(dǎo)的JNK、P38MAPK、ERK蛋白磷酸化水平的影響（n=5） 注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

文獻(xiàn)報道TRIM家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、個體發(fā)育、腫瘤及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程發(fā)揮重 要的作用。比如TRIM45可與膜轉(zhuǎn)運家族蛋白SLC25A3以及熱休克家族蛋白DNAJB6發(fā)生相互作用，通過阻斷鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生。肌肉特異性TRIM家族蛋白MG53是心臟缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC）的組成部分，MG53表達(dá)下調(diào)可加重心肌缺血-再灌注損傷并取消IPC保護(hù)作用，而過表達(dá)MG53可減弱缺氧和H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡，其作用機(jī)制為MG53依賴的caveolin-3與磷脂酰肌醇3激酶的相互作用和隨后再灌注損傷補救激酶通路的激活［15］。TRIM10為TRIM家族成員之一，具有TRIM家族所共有的結(jié)構(gòu)域，具有E3連接酶的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明TRIM10可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、紅系細(xì)胞生成以及成年小鼠的紅細(xì)胞分化與增殖。本研究發(fā)現(xiàn)敲低TRIM10可減少H/R誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生和心肌細(xì)胞的凋亡，而過表達(dá)則加重以上改變，說明TRIM10參與了心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧的發(fā)生。

近些年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是心肌發(fā)生缺血-再灌注損傷重要的環(huán)節(jié)之一［16］，而絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號途徑介到了心肌凋亡的發(fā)生。MAPKs存在于所有生物體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是真核生物細(xì)胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與細(xì)胞的增殖、存活、分化和凋亡等密切相關(guān)。其主要家族成員主要包括ERKs，JNKs和p38MAPKs。目前的研究證實P38、JNK的激活參與了心肌細(xì)胞促凋亡的過程［17］。Kasier等的研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK的激活或過度表達(dá)p38MAPK基因均使缺血-再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，心功能降低［18］。抑制JNK活性后能夠保護(hù)心肌損傷，減小心梗面積和細(xì)胞凋亡［19］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)敲低TRIM10可減輕H/R誘導(dǎo)的P38MAPK、JNK蛋白的磷酸化水平，提示TRIM10可能是通過激活P38MAPK和JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的發(fā)生。

總之，本實驗研究發(fā)現(xiàn)泛素E3連接酶TRIM10可加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡進(jìn)而參與心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的發(fā)生，其機(jī)制可能為通過激活P38MAPK和JNK通路所介導(dǎo)，但是仍需要在基因敲除和過表達(dá)小鼠模型中進(jìn)一步驗證TRIM10的作用及其靶分子。