大蒜素激活Notch信號靶向誘導(dǎo)sGC轉(zhuǎn)錄預(yù)防大鼠高血壓的機(jī)制研究

張 磊 李會芳 伍文彬 劉紅梅 楊海艷 王 飛

高血壓是一種常見的心腦血管疾病，易導(dǎo)致冠心病、動脈硬化和心肌梗塞等疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮功能參與血管張力的調(diào)節(jié)，與動脈高血壓聯(lián)系緊密，對維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)十分重要，內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致高血壓發(fā)生的關(guān)鍵之一［2］。Notch信號通路在心臟及血管的發(fā)育和分化中發(fā)揮重要作用，Notch受體與配體結(jié)合后，釋放胞內(nèi)段受體至細(xì)胞核內(nèi)，并與RBPJ等轉(zhuǎn)錄因子和MAML2等激活蛋白結(jié)合共激活下游靶基因。sGC能夠產(chǎn)生環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），cGMP參與內(nèi)皮依賴性的NO-cGMP信號通路，并通過調(diào)控離子通道、磷酸二酯酶和蛋白激酶等方式調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能和血壓［3-4］。此外，大蒜素被證實(shí)能夠激活胞內(nèi)Ca2+離子通道從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性的血管舒張［5］，其具有強(qiáng)效抗氧化的作用，能夠有效保護(hù)患者的內(nèi)皮功能并降低高血壓患者的血管收縮壓和舒張壓［6］，但其具體機(jī)制不明。基于以上，本文推測大蒜素保護(hù)血管內(nèi)皮的機(jī)制可能與Notch信號調(diào)節(jié)血管中cGMP的產(chǎn)生有關(guān)。具體研究如下:

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料 60只，體質(zhì)量為180～220 g的實(shí)驗(yàn)大鼠，購自成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，其中原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）40只，假手術(shù)組（Sham）20只。用于提取動脈血管RNA的纖維類組織RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技公司，反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購自promega公司，兔抗大鼠Notch3、GUCY1A1、MAML2、FRYL、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR） 和GAPDH抗體購自proteintech公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司，ECL顯色液購自美國Thermo公司，大蒜素Allicin（15 mg/mL，20130316）購自徐州萊恩藥業(yè)有限公司、去氧腎上腺素粉劑phenylephrine（500 mg，PHR1017）和乙酰膽堿粉劑Acetylcholine（25 g，A6625）均購自美國sigma公司，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑購自Promega公司，轉(zhuǎn)染試劑X-tremegene購自羅氏公司，小干擾RNA si-Notch3由上海吉瑪公司合成。

2.實(shí)驗(yàn)方法 （1）實(shí)驗(yàn)動物分組及處理:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將60只實(shí)驗(yàn)大鼠分為三組:假手術(shù)組（sham），高血壓組（SHR）和大蒜素處理高血壓大鼠組（SHR+Allicin），每組20只。SHR+Allicin組每天喂食30 mg/kg的大蒜素/水混合液（大蒜素和水體積比1∶9），共喂食14 d，分別在0 d、7d和14 d對三組大鼠進(jìn)行觀察。

（2）大鼠血管收縮壓檢測:采用ALC-NIBP無創(chuàng)血壓測量儀檢測三組大鼠尾動脈血管的收縮壓，每只大鼠檢測三次，檢測時間點(diǎn)為給藥的第0 d、7d和14 d，取平均值作為最終數(shù)據(jù)結(jié)果。

（3）血管反應(yīng)性及內(nèi)皮功能檢測:給藥14 d后，從sham組、SHR組和SHR+Allicin組大鼠尾動脈剝離具有完整內(nèi)皮的長約3～4 mm的血管環(huán)，經(jīng)40 mM KCl處理預(yù)處理兩次后，再采用不同濃度的乙酰膽堿（10-9～10-4M）和去氧腎上腺素（10-9～10-4M）分別評估內(nèi)皮功能和血管反應(yīng)性。

（4）細(xì)胞培養(yǎng):人類主動脈血管平滑肌細(xì)胞（T/G HA-VSMCs）購自美國ATCC公司，細(xì)胞培養(yǎng)采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（購自Hyclone公司）。轉(zhuǎn)染或大蒜素處理前，保證細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～80%。處理時，每孔加入2 mg的大蒜素或2μg si-Notch3干擾小RNA片段，處理24 h后進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)檢測。

（5）實(shí)時定量PCR檢測:采用纖維類組織RNA提取試劑盒提取各組大鼠尾動脈血管組織及T/G HA-VSMCs細(xì)胞的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，熒光定量PCR檢測Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、GUCY1A1、GUCY1B1、MAML2、FRYL、VEGF和VEGFR的表達(dá)水平。各檢測基因的QPCR引物見表1。QPCR結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

表1 QPCR檢測引物

（6）western blot檢測:向T/G HA-VSMCs細(xì)胞中加入RIPA蛋白裂解液，至4℃離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min，吸取上清加入4倍體積的SDS loading buffer，混勻后放入100℃水浴5 min。取30 μg的蛋白裂解液加入8%SDS-PAGE凝膠中分別以60 V和100 V電壓進(jìn)行蛋白濃縮和分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，以10%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入兔抗大鼠Notch3、GUCY1A1、MAML2、FRYL、VEGF和VEGFR抗體，4℃過夜孵育后，ECL發(fā)光液顯色。

（7）熒光素酶報告載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:采用MEME在線預(yù)測GUCY1A1啟動子上游2 000 bp的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)-944 bp處存在RBPJ的結(jié)合位點(diǎn)atcacat。從人基因組中釣取GUCY1A1啟動子片段，并構(gòu)建入pGL3-basic載體中。帶酶切位點(diǎn)的引物為Kpn I-GUCY1A1-F:GGTACC TTTAGCTGAAACCGTTGA，Nhe I-GUCY1A1-R:GCTAGC GTAGCGTTGTGATGGATC，構(gòu)建成功后提取質(zhì)粒，命名為pGL3-Wt。GUCY1A1啟動子上RBPJ位點(diǎn)的缺失突變由上海生工公司完成，采用DNA合成技術(shù)合成不含有atcacat位點(diǎn)的GUCY1A1啟動子，并將此序列克隆至pGL3-basic載體，命名為pGL3-Mut。實(shí)驗(yàn)組將pGL3-Wt或pGL3-Mut與pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染入T/G HA-VSMCs細(xì)胞中，對照組轉(zhuǎn)染pGL3-basic與pRL-TK，每孔轉(zhuǎn)染劑量為2μg。轉(zhuǎn)染24 h后，裂解細(xì)胞并采用promega熒光素酶分析儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，兩者比值為熒光素酶的相對活性。

（8）染色質(zhì)免疫共沉淀:取出生長至90%以上的細(xì)胞，加入37%多聚甲醛，室溫交聯(lián)10 min后，加入甘氨酸終止交聯(lián)。將細(xì)胞培養(yǎng)基吸出，加入預(yù)冷的PBS潤洗兩次后，將細(xì)胞刮下并4℃下以2 000 r/min離2 min，收集細(xì)胞沉淀加入SDS Lysis Buffer后進(jìn)行超聲破碎。將超聲后的細(xì)胞分為3組:input組、IgG陰性對照組和加anti-Notch3抗體組。4℃過夜孵育后，于每組加入ProteinA磁珠，孵育2 h后洗滌沉淀復(fù)合物。將洗滌后的DNA片段用于QPCR分析，設(shè)計(jì)GUCY1A1啟動子-944位點(diǎn)的QPCR引 物， 上 游:5'-AGCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3'； 下 游:5'-CCTGCAGTAGGTTTCTGCTGCCTTG-3'。 以input為內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對值。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6.05軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析One-Way ANOVA和Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大蒜素降低SHR大鼠的血管收縮壓和血管反應(yīng)性，并增強(qiáng)血管內(nèi)皮功能 由表2可知，SHR組和SHR+Allicin組大鼠的尾動脈血管收縮壓在7 d和14 d明顯高于Sham組，SHR+Allicin組的血管收縮壓顯著低于SHR組，提示大蒜素對SHR大鼠具有降血壓的效果。由圖1可知，與sham組相比，去氧腎上腺素隨濃度增高能夠明顯增加SHR組大鼠的血管反應(yīng)性，但SHR+Allicin組大鼠的血管反應(yīng)性則較SHR組顯著降低；乙酰膽堿處理后，相比Sham大鼠，SHR組大鼠的血管內(nèi)皮功能明顯降低，而SHR+Allicin組大鼠血管內(nèi)皮功能則明顯恢復(fù)，幾乎與Sham一致，提示大蒜素能夠降低血管收縮壓、血管反應(yīng)性和增強(qiáng)血管內(nèi)皮功能。

圖1 大鼠主動脈血管反應(yīng)性及內(nèi)皮功能檢測 注:與Sham組比較，a P＜0.05；與Sham組比較，b P＜0.01；與SHR+Allicin組比較，c P＜0.05；與SHR+Allicin組比較，d P＜0.01

圖2 大蒜素激活高血壓大鼠主動脈血管的Notch3信號并誘導(dǎo)GUCY1A1的表達(dá) 注:**P＜0.01，ns:P＞0.05

表2 大鼠血管不同時間收縮壓檢測（mmHg，）

表2 大鼠血管不同時間收縮壓檢測（mmHg，）

注:1 mmHg=0.133 kPa，與Sham組比較，a P＜0.05；與Sham組比較，b P＜0.01；與SHR組比較，c P＜0.05；與SHR組比較，d P＜0.01

組別 個數(shù) 0 d 7 d 14 d Sham 20 110.50±5.80 112.10±3.90 113.10±4.20 SHR 20 115.22±4.11 173.29±2.73b 176.21±3.13b SHR+Allicin 20 120.10±7.51 135.40±5.11ac 126.51±4.88ad F值 0.153 10.622 12.112 P值 0.375 0.007 0.002

2.大蒜素激活高血壓大鼠尾動脈血管的Notch3信號并誘導(dǎo)GUCY1A1的表達(dá) 檢測4個Notch信號受體Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，以及sGC編碼基因GUCY1A1和GUCY1B1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch1-3以及GUCY1A1和GUCY1B1在SHR大鼠中的表達(dá)均顯著低于sham組（P＜0.01），而僅有Notch3和GUCY1A1的表達(dá)水平在SHR+Allicin組中有明顯回升（P＜0.01），提示大蒜素能夠激活Notch3受體，并誘導(dǎo)GUCY1A1的表達(dá)。

為證明大蒜素能夠同時誘導(dǎo)Notch3和GUCY1A1的表達(dá)，進(jìn)一步采用相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)無論在SHR組 還 是SHR+Allicin組，Notch3和GUCY1A1的表達(dá)水平均呈明顯正相關(guān)（SHR:r=0.507 6，P=0.022 3；SHR+Allicin:r=0.467 2，P=0.037 8）。

圖3 大蒜素處理及Notch3的瞬時干擾對Notch通路及血管相關(guān)基因的影響 注:**P＜0.01

圖4 GUCY1A1啟動子轉(zhuǎn)錄活性及RBPJ轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的鑒定 注:**P＜0.01

3.大蒜素處理及Notch3的瞬時干擾對Notch通路及血管相關(guān)基因的影響 采用si-Notch3的瞬時干擾、QPCR及western blot技術(shù)檢測大蒜素處理后的血管平滑肌細(xì)胞（T/G HA-VSMCs）中Notch信號相關(guān)基因（Notch3、MAML2和FRYL）、sGC編碼基因GUCY1A1、以及反應(yīng)血管內(nèi)皮功能的因子（VEGF和VEGFR）的表達(dá)水平。如圖3所示，大蒜素能夠顯著增加T/G HA-VSMCs中Notch3、GUCY1A1、VEGF和VEGFR的表達(dá)，但對MAML2和FRYL的表達(dá)無影響，因此證明，大蒜素能夠增強(qiáng)notch3信號和促進(jìn)GUCY1A1的表達(dá)，但無法激活notch信號的共激活蛋白MAML2和FRYL的表達(dá)。干擾Notch3信號導(dǎo)致大蒜素誘導(dǎo)的Notch3、GUCY1A1、VEGF和VEGFR的表達(dá)明顯降低，對MAML2和FRYL的表達(dá)無影響，提示GUCY1A1、VEGF和VEGFR是Notch3的下游基因，Notch3可能通過靶向誘導(dǎo)GUCY1A1表達(dá)從而增強(qiáng)血管內(nèi)皮功能。

4.GUCY1A1啟動子轉(zhuǎn)錄活性及RBPJ轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的鑒定 據(jù)文獻(xiàn)報道可知，Notch信號進(jìn)入細(xì)胞核后與轉(zhuǎn)錄因子RBPJ、共激活蛋白MAML2和FRYL結(jié)合共同靶向激活下游基因的表達(dá)［7-8］。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測GUCY1A1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp啟動子并分析其-944 bp存在潛在的RBPJ結(jié)合位點(diǎn)atcacata，進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫共沉淀和熒光素酶報告系統(tǒng)對大蒜素和si-Notch3處理后的T/G HA-VSMCs進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠增強(qiáng)Notch3復(fù)合物與atcacata位點(diǎn)的結(jié)合并增強(qiáng)GUCY1A1啟動子的活性，干擾Notch3則阻遏了大蒜素對GUCY1A1啟動子活性的增強(qiáng)作用；通過缺失突變GUCY1A1啟動子上的atcacata位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)與未處理組相比（mock），經(jīng)大蒜素誘導(dǎo)的GUCY1A1啟動子活性幾乎未發(fā)生改變，且干擾Notch3后的GUCY1A1啟動子活性亦無明顯變化。以上結(jié)果證實(shí)大蒜素能夠促進(jìn)Notch3與GUCY1A1啟動子結(jié)合，并增強(qiáng)GUCY1A1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

討 論

內(nèi)皮對于維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，血管的內(nèi)皮依賴性擴(kuò)張是影響血管內(nèi)皮功能的主要因素，健康的內(nèi)皮細(xì)胞能夠連續(xù)釋放多種生化物質(zhì)，以自分泌、旁分泌和全身方式參與平滑肌收縮、血管壁通透性、血小板聚集、凝血、纖溶活性的活化和細(xì)胞增殖，此外還能防止炎性細(xì)胞粘附血管，而內(nèi)皮功能受損則會引起以上功能失調(diào)，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生［9］。內(nèi)皮功能障礙對血管反應(yīng)和血壓調(diào)節(jié)具有重要影響，本研究通過對高血壓大鼠口服大蒜素，發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠的血管反應(yīng)性顯著降低，內(nèi)皮功能則顯著提高，證實(shí)大蒜素對血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用。通過檢測血管收縮壓，進(jìn)一步證實(shí)大蒜素對SHR大鼠具有降血壓功能并能夠長期維持其降血壓的效果。

可溶性鳥苷酸環(huán)化酶sGC是一氧化氮NO的唯一受體，sGC與NO結(jié)合會催化cGMP才產(chǎn)生，形成NO-sGC-cGMP通路并調(diào)節(jié)血管重塑和炎癥反應(yīng)，從而參與心血管疾病的發(fā)生。sGC由α和β兩種亞基構(gòu)成，編碼基因分別是GUCY1A1和GUCY1B1。研究表明GUCY1A1和GUCY1B1主要表達(dá)在大多數(shù)器官的血管壁中，通過調(diào)節(jié)GUCY1A1和GUCY1B1的表達(dá)可以控制sGC和cGMP的產(chǎn)生，進(jìn)一步參與高血壓的調(diào)節(jié)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠尾動脈血管中的GUCY1A1和GUCY1B1表達(dá)顯著下調(diào)，而大蒜素處理后的高血壓大鼠血管中的GUCY1A1表達(dá)水平明顯升高，GUCY1B1則無顯著變化，提示GUCY1A1可能是參與高血壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因。一些研究認(rèn)為Notch信號通路可能是調(diào)控高血壓疾病發(fā)生的關(guān)鍵通路，原因之一在于notch是sGC表達(dá)調(diào)控因子，chang等亦發(fā)現(xiàn)notch的共激活轉(zhuǎn)錄因子RBPJ在GUCY1A1和GUCY1B1啟動子區(qū)域存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)［11-12］。這些依據(jù)提示Notch通路參與高血壓的調(diào)節(jié)，其機(jī)制可能是通過調(diào)控sGC的表達(dá)。在Notch的4個受體中，Notch3主要在遠(yuǎn)端動脈的血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，主要參與動脈血管的分化和成熟［13］，Notch3功能缺失則會促進(jìn)血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓發(fā)生［14］。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠的notch1-notch4的表達(dá)水平均明顯低于sham組，而經(jīng)大蒜素處理的高血壓大鼠中僅notch3的表達(dá)明顯回升，進(jìn)一步采用相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)notch3和GUCY1A1在SHR組和SHR+Allicin組大鼠中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示notch3是參與高血壓調(diào)節(jié)的主要受體。

為證實(shí)notch3參與大蒜素對大鼠高血壓的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究采用大蒜素和Notch3干擾小RNA片段處理血管平滑肌細(xì)胞（T/G HA-VSMCs），發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠誘導(dǎo)notch3、GUCY1A1、VEGF和VEGFR的表達(dá)，si-Notch阻遏了大蒜素的誘導(dǎo)效果，但參與notch信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控的MAML2和FRYL的表達(dá)水平無明顯變化，提示大蒜素可能通過誘導(dǎo)notch3受體表達(dá)從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能，而不是通過誘導(dǎo)notch信號的共激活蛋白MAML2和FRYL。采用生物信息學(xué)分析GUCY1A1啟動子，發(fā)現(xiàn)其上游-944 bp處存在RBPJ的潛在結(jié)合位點(diǎn)atcacata。經(jīng)染色質(zhì)免疫共沉淀和熒光素酶報告系統(tǒng)方法證實(shí)大蒜素能夠增強(qiáng)Notch3轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和GUCY1A1啟動子的結(jié)合，并提高其轉(zhuǎn)錄活性，而si-Notch3則阻遏了兩者的結(jié)合能力和GUCY1A1啟動子活性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠保護(hù)SHR大鼠的血管內(nèi)皮功能并降低其血管收縮壓和血管反應(yīng)性，其主要機(jī)制可能是通過激活Notch3信號形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，并通過轉(zhuǎn)錄激活GUCY1A1誘導(dǎo)sGC的產(chǎn)生，這為大蒜素用于高血壓的防治提供新的理論依據(jù)。