應用組織芯片技術分析53BP1在結腸癌中的表達及意義

孫 濤，張 園，朱長軍

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤防治研究所，烏魯木齊 830011）

結腸癌作為全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，患者死亡率在常見的惡性腫瘤患者死亡率中位居第2位[1]，在我國的年均發(fā)病率高達4%[2].近年來，結腸癌患者數(shù)量不斷增加，年齡逐漸趨向年輕化，且男性發(fā)病率大于女性[3].目前，對結腸癌早期診斷的水平仍較低，如傳統(tǒng)的免疫法糞便隱血試驗、CT 仿真結腸鏡、膠囊結腸鏡等技術，均存在特異性差、假陽性高、適用范圍狹窄等缺點[4-7].據(jù)統(tǒng)計，近1/3 患者確診時已處于結腸癌的進展期或晚期.Shane 等[8]研究表明，早期結腸癌患者愈后5年生存率為80%，進展期結腸癌患者愈后5年生存率僅為50%.因此選擇適當?shù)脑缙谀[瘤標志物進行聯(lián)合檢查，提高早期結腸癌診斷率，成為延長結腸癌患者生存率的重要手段[9].

細胞基因組穩(wěn)定性對細胞的正常生長增殖至關重要.如果細胞增殖過程中發(fā)生DNA 損傷又不能及時修復，就會導致細胞走向死亡或引起基因組不穩(wěn)定，最終誘發(fā)腫瘤.細胞為保護基因組的穩(wěn)定性不被DNA 損傷所破壞，進化出了精密的DNA 損傷修復機制.其中，對于DNA 雙鏈損傷（DSBs）的修復主要由末端連接（NHEJ）和同源重組修復（HR）2 個途徑完成.NHEJ 途徑貫穿整個細胞周期，HR 卻只出現(xiàn)在S/G2期[10].HR 途徑能確保DSBs 處修復后與原本序列一致，從而保證了基因組的完整性和穩(wěn)定性.因此，參與調控HR 途徑的關鍵蛋白既是目前DNA 損傷修復研究領域的熱點，也是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要蛋白.p53 結合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）是HR 途徑上的一個成員，DNA 發(fā)生雙鏈斷裂損傷時，磷酸化修飾后的53BP1 如果聚集到DSBs 處，會阻止HR 的進行[11-13].53BP1的高表達或功能異常往往會造成細胞基因組不穩(wěn)定，引起腫瘤的發(fā)生.

為了深入研究53BP1 蛋白分子與結腸癌發(fā)生發(fā)展之間的關系，本課題組嘗試了幾種市場化的抗53BP1 蛋白抗體，細胞水平的預實驗結果顯示這些抗體均不能滿足實驗需要.為此，本研究設計了53BP1蛋白分子的抗原多肽并將其應用于特異性抗53BP1多克隆抗體的制備.應用該抗體對31例結腸癌組織及其癌旁組織進行免疫組化檢測，結合臨床病例資料分析和ONCOMINE數(shù)據(jù)庫檢索，探究53BP1 在結腸癌組織中的表達情況.本研究結果將為53BP1 應用于結腸癌的早期診斷提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

骨肉瘤細胞株U2-OS、人子宮頸癌細胞株Hela 均為本實驗室自存.

1.1.2 試劑

蛋白預染Marker，日本Takara 公司；胎牛血清、胰蛋白酶，美國GIBCO 公司；HRP 標記的二抗，美國Invitrogen 公司；細胞完全培養(yǎng)基DMEM，北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；免疫組化試劑盒，美國BOSTER公司；結腸癌組織芯片，武漢谷歌生物科技有限公司（芯片編號：DZX2017.9）；Protein A 耦聯(lián)的瓊脂糖凝膠柱，上海碧云天生物技術有限公司；抗53BP1抗體的抗原多肽CIEDSQPESQVLEDD（根據(jù)53BP1 蛋白分子一級結構中的第21 位至第35 位氨基酸設計制備），由武漢丹港生物科技有限公司合成.

1.1.3 儀器

蛋白電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Nikon TS-100 FL倒置熒光顯微鏡和Nikon 90i 共聚焦熒光顯微鏡，日本Nikon 公司.

1.2 方法

1.2.1 抗體制備

設計合成抗原多肽CIEDSQPESQVLEDD 并將其偶聯(lián)到載體血藍蛋白（KLH）上，與抗體佐劑以1 ∶1 的體積比混勻，皮下注射入新西蘭大白兔背部.第一次注射抗原多肽前，耳緣靜脈取血作為免疫前血清.每次注射抗原多肽一周后，耳緣靜脈取血制備血清并進行血清驗證，一直持續(xù)3～5 個月.血清驗證得到高滴度的特異性抗53BP1 抗體后，將兔子從股動脈放血，得到終血清（約50 mL）.

1.2.2 抗體血清驗證

將長滿10 cm2平皿的U2-OS 細胞（約8.8×107）置于冰上，吸去培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，加1 mL 的PBS并用干凈的細胞刮沿同一方向將細胞收集到1.5 mL離心管中.在4 ℃、1 000 r/min 條件下，離心3 min，吸去PBS.用880 μL 的RIPA 裂解液將細胞沉淀吹吸均勻，置于冰上1 h.將細胞裂解液于4 ℃、14 000 r/min 條件下離心30 min，取上清液200 μL 并加入1 μL 血清，4 ℃下孵育過夜.次日取20 μL 的Protein A beads與細胞裂解液在4 ℃條件下繼續(xù)孵育2 h.隨后在4 ℃、1 000 r/min 條件下離心3 min，并用RIPA 裂解液洗3次.之后取沉淀，加入20 μL 的2×loading buffer，95 ℃下煮樣5 min，4 ℃、14 000 r/min 條件下離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE 和Western blot 檢測.

1.2.3 細胞免疫熒光染色

用體積分數(shù)為3%的福爾馬林和質量分數(shù)為2%的蔗糖的PBS 溶液在室溫下處理細胞15 min，PBS 洗3 次后用濃度為0.1 mol/L 甘氨酸的PBS 溶液浸泡細胞5 min.用體積分數(shù)為10%的血清和質量分數(shù)為0.4%的Triton X-100 的PBS 溶液封閉細胞30 min.二抗為FITC 或Texas Red 標記的羊源二抗，采用DAPI 染色DNA.一抗（53BP1 抗血清）室溫孵育2 h，二抗室溫避光孵育1 h，DAPI 室溫避光孵育3 min.

1.2.4 免疫組化染色檢測

應用通用型免疫組化試劑盒進行組織標本免疫組化染色實驗.首先對組織芯片進行脫蠟處理，然后進行抗原修復，接著用山羊血清對組織芯片進行封閉處理30min.倒干液體，加入適量53BP1 抗血清（與PBST 按照體積比1 ∶500 稀釋）于組織切片上，室溫孵育1 h.PBS洗3 次，每次2 min，加入HRP 偶聯(lián)的二抗（與PBST按照體積比1 ∶500 稀釋）室溫孵育20 min.PBS 洗3 次，每次2 min，加入DAB 顯色液.鏡下觀察染色情況，之后用水沖洗.對組織切片進行梯度脫水，即將載玻片依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯中，每種試劑中放置5 min，最后封片.

1.2.5 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫檢索

登錄ONCOMINE網(wǎng)站，在搜索欄（search）輸入53BP1，限制搜索條件，檢索53BP1 在結腸癌組織中的表達.

1.2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，通過卡方檢驗，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 53BP1的抗血清驗證

將化學合成的53BP1 抗原多肽與KLH 偶聯(lián)，對新西蘭大白兔進行皮下注射.免疫5 次后抽血，離心之后可得到抗血清.收集U2-OS 細胞進行免疫共沉淀實驗檢測該抗血清的特異性，結果如圖1 所示.由圖1 可以看出，在53BP1 抗血清IP 泳道和1/10 全細胞裂解液泳道約220×103處檢測到了條帶.

圖1 蛋白免疫沉淀實驗對53BP1 抗血清結合內源53BP1 分子的鑒定Fig.1 Identification of endogenous 53BP1 protein molecules combined with 53BP1 antibody by immunoprecipitation experiment

通過免疫熒光染色實驗，對體外培養(yǎng)的HeLa 細胞進行53BP1 和DNA 的染色，在熒光顯微鏡下進行觀察，結果如圖2 所示.由圖2 可以看出，與DNA 染色結果進行對比發(fā)現(xiàn)，53BP1 絕大部分定位在間期細胞的細胞核位置，少數(shù)游離于細胞核外.

圖2 53BP1 抗血清的細胞免疫熒光實驗鑒定（10×）Fig.2 Appraisal 53BP1 antibody by immunofluorescence experiment（10×）

應用免疫組織化學染色技術，用53BP1 抗血清和蘇木精分別對同一結腸癌組織的2 張切片進行染色，結果如圖3 所示.比較53BP1 抗血清染色和蘇木精染色結果可以看出，53BP1 抗血清在結腸癌組織中的著色位置與蘇木精的著色位置基本一致，主要定位于組織中的細胞核.

圖3 53BP1 抗血清的免疫組織化學染色鑒定Fig.3 Appraisal 53BP1 antibody by immunohistochemical staining

以上結果表明，本研究制備的53BP1 抗血清具有特異性，可以應用于臨床病理組織的免疫組織化學染色.

2.2 53BP1表達與結腸癌臨床病理因素的關系

應用上述53BP1 抗血清對結腸癌組織芯片進行免疫組織化學染色，結果如圖4 所示.

圖4 53BP1 抗血清的免疫組織化學染色Fig.4 Immunohistochemical staining with 53BP1 antibody

通過對圖4 中組織著色深淺的分析，比較53BP1在31 個病例中癌組織和癌旁組織的表達，結果如圖5 所示.由圖5 可以看出，在結腸癌組織中，53BP1的表達量高于癌旁組織，通過無重復雙因素分析，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）.

圖5 53BP1 在結腸癌組織與癌旁組織中的表達Fig.5 Expression of 53BP1 in colorectal cancer and tissues adjacent to cancer

利用上述結腸癌組織芯片的53BP1 染色結果，分析它在不同TNM 分期的癌組織與癌旁組織中的表達差異，結果如圖6 所示.由圖6 可以看出，在所有結腸癌TNM 分期中，癌組織中的53BP1表達量均高于癌旁組織中的表達量，其中，Ⅱ期結腸癌患者癌組織與癌旁組織中表達量的差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）.Ⅰ期結腸癌組織中的53BP1 也呈現(xiàn)高表達，但癌組織與癌旁組織中的表達量差異不具有統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）.

圖6 53BP1 在不同TNM 分期的結腸癌組織與癌旁組織中的表達Fig.6 Expression of 53BP1 in colorectal cancer and tissues adjacent to cancer with different TNM stages

統(tǒng)計不同結腸癌臨床病理因素中53BP1的表達量，結果如表1 所示.由表1 可以看出，結腸癌組織中53BP1的高表達與腫瘤大小和TNM 分期密切相關：當腫瘤組織≥4 cm 時，17 例結腸癌患者中有15例患者的53BP1 高表達，顯著高于腫瘤組織＜4 cm 患者的表達比例； 在TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期的結腸癌患者中，16 例患者中有14 例患者的53BP1 高表達，顯著高于Ⅲ-Ⅳ期患者的表達比例.53BP1的高表達與患者的年齡、性別、分級、腫瘤是否轉移等相關性不顯著.

表1 53BP1 蛋白分子與結腸癌臨床病理因素的關系Tab.1 Relationship between 53BP1 and colorectal cancer tissue in clinical pathological features

2.3 基于ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析53BP1 在結腸癌中的表達

檢索ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中53BP1在結腸癌中的表達，結果如圖7 所示.由圖7 可以看出，53BP1 在結腸癌組織中的表達水平明顯高于正常組織.

圖7 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫檢索的53BP1 在結腸癌中的表達Fig.7 Expression of 53BP1 in colorectal cancer in the ONCOMINE database

3 討論與結論

53BP1 是DNA 雙鏈損傷（DSB）修復途徑中一個重要的蛋白分子，能在DSB 發(fā)生后第一時間被磷酸化且聚集在DNA 損傷處，被公認為DNA 雙鏈損傷的標志分子之一[14].若53BP1 功能異?；蛘弑磉_量升高，則會阻止DSB 修復，進而導致細胞基因組不穩(wěn)定，使細胞發(fā)生死亡或者癌變.此外，53BP1 還具有其他生理功能，如調控細胞周期等[15].因此，該蛋白分子可作為一個重要的潛在分子標志物，用于檢測腫瘤的發(fā)生發(fā)展.

本研究設計了53BP1 抗原多肽，通過免疫新西蘭大白兔制備抗53BP1 血清，將該抗血清應用于免疫共沉淀實驗后，在220×103處檢測到條帶，說明該抗血清能特異性結合53BP1 蛋白分子，輔以細胞免疫熒光實驗和免疫組織化學染色實驗的鑒定.將上述結果與其他研究對比后，確定了該抗體的特異性，證明該抗體可以應用于結腸癌組織芯片的免疫組織化學染色實驗[12-15].對結腸癌組織芯片的免疫組織化學染色結果進行分析，并結合ONCOMINE數(shù)據(jù)庫檢索結果得出，53BP1 在結腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，且與結腸癌組織大小和TNM 分期有關.在腫瘤組織≥4 cm 的病例中癌組織的53BP1表達量比癌旁組織高；同時，在結腸癌Ⅱ期中，癌組織的53BP1表達水平明顯高于癌旁組織.因此，53BP1 在早期結腸癌組織中高表達，可能會促進腫瘤的生長.當腫瘤發(fā)展到Ⅱ期時，53BP1的高表達可能會促進腫瘤向周圍組織浸潤.但當結腸癌進入Ⅲ期、Ⅳ期時，出現(xiàn)淋巴結轉移和/或遠端轉移，癌組織和癌旁組織中的53BP1表達無顯著差異，預示53BP1 可能與結腸癌的轉移沒有相關性.本研究結果表明53BP1 是一個潛在的結腸癌早期分子標志物，這些研究為53BP1 應用于臨床結腸癌的早期診斷提供了實驗依據(jù).