紙基薄層快速凈化策略及辣椒油中痕量殘留檢測(cè)方法研究

何連軍 李詩言 賴姝毓 張宜明 龐林江 戴 丹

(杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院1，杭州 310018)

(浙江水產(chǎn)技術(shù)推廣總站2，杭州 311300)

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院3，杭州 311300)

(浙江農(nóng)林大學(xué)信息工程學(xué)院4，杭州 311300)

基質(zhì)是樣品中被分析物以外的物質(zhì)，對(duì)分析物的分析過程有著顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年，針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的樣品制備和凈化技術(shù)獲得了飛速發(fā)展并廣泛地應(yīng)用于食品安全、化學(xué)和環(huán)境分析領(lǐng)域。固相萃取(Solid phase extraction,SPE)、凝膠色譜(Gel polymer chromatography,GPC)以及快速固相分散萃取(QuEChERS)等新技術(shù)在食品安全分析中得到了廣泛的應(yīng)用[1-7]。

糧油食品加工過程中可能涉及到一些非法添加劑加入[8]，如辣椒油中可能會(huì)違規(guī)添加蘇丹紅等非人工合成染料色素。一般認(rèn)為蘇丹紅I 的濃度在100～1000mg/kg之間才能賦予相應(yīng)食品應(yīng)有的顏色[3]。蘇丹紅I的log P值大約在5.86，這意味著其有著非常高的脂溶性[4]。針對(duì)諸如油脂類復(fù)雜基質(zhì)樣品，目前國(guó)標(biāo)法檢測(cè)樣品前處理步驟包括旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氧化鋁柱層析富集、氮吹濃縮等，但其操作復(fù)雜，涉及設(shè)備和轉(zhuǎn)移步驟多，溶劑消耗大，流程長(zhǎng)易造成組分損失和污染。因此，開發(fā)新的快速凈化策略并同時(shí)達(dá)到節(jié)約溶劑、環(huán)境友好的效果有著科學(xué)與實(shí)踐意義。

薄層色譜(Thin laye chromatography, TLC)作為一種傳統(tǒng)的分離方法，在樣品分析或制備中獲得廣泛應(yīng)用[9]。然而，現(xiàn)有薄層色譜法存在上樣量不足、分析方法靈敏度不足等某些缺點(diǎn)。隨著液相色譜-質(zhì)譜方法的普及，儀器分析的靈敏度獲得較大提升從而彌補(bǔ)了薄層層析的樣品通量不足缺點(diǎn)[10]。本研究選擇蘇丹紅作為油脂類樣品食品污染物的模擬底物[11,12]，采用柔性紙基薄層色譜條帶建立紙基薄層凈化策略，探索紙基薄層凈化條帶在凈化策略的可行性，凈化后的辣椒油樣品通過液相色譜或串聯(lián)質(zhì)譜等設(shè)備能靈敏地檢測(cè)這些化合物，整個(gè)過程快速、簡(jiǎn)便、節(jié)省溶劑。本研究針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的油脂樣品提供了一種凈化和痕量殘留的檢測(cè)策略，并有望應(yīng)用于其他食品安全分析領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硅膠G60作為薄層條帶固定相(200～400目)，亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃、蘇丹紅染料標(biāo)準(zhǔn)溶液、聚氯乙烯(PVC)涂布紙；對(duì)照固相萃取小柱采用蘇丹紅專用小柱(ProElut SDH，500mg，6mL，Partnumber：65909)；樣品為低油脂含量樣品為辣椒粉樣品(辣椒油的主要原料之一)，高油脂樣品為辣椒油樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-Ⅱ電動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)，玻璃展開缸(100cm×200cm)，真空抽濾裝置，分析天平，均質(zhì)器，其他輔助儀器包括氮?dú)獯祾咂鳌KA均質(zhì)、振動(dòng)、水浴聲波發(fā)生器；旋轉(zhuǎn)器蒸發(fā)工具，恒溫水浴鍋；采用12通道手動(dòng)固相萃取裝置；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及相關(guān)色譜柱；分析儀器主要包括ExionLC AD系列液相色譜儀、4500Qtrap三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀。

1.3 紙箔薄層色譜板的制備

聚乙烯(PC)涂布紙(A4打印紙尺寸)被用作薄層基材。首先取適量硅膠G60、黏合劑羧甲基纖維素與水混合成為待涂覆固定相，用鐵尺刷在涂布紙表面，然后在85℃的烘箱中干燥30min，儲(chǔ)存在干燥器中待使用。紙基薄層色譜條帶的制備細(xì)節(jié)可參見之前的工作[13]，可根據(jù)試樣含油脂量的不同類型，可在紙箔背板上用鉛筆標(biāo)記出特征靶區(qū)標(biāo)記。

1.4 油脂類樣品的制備與凈化

1.4.1固相萃取凈化

固相萃取凈化是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室常用的凈化手段，針對(duì)本研究底物油脂中的蘇丹紅，固相萃取方案參考采用了目前技術(shù)上成熟的迪馬科技ProElut SDH固相萃取柱和相關(guān)處理程序，并作為TLC凈化的常規(guī)對(duì)照方法。首先稱取0.5g辣椒油樣品(加標(biāo)樣品在樣品中加入不同濃度蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液)，以10mL乙腈均質(zhì)攪拌5min，超聲提取5min，8000r/min下離心2min，將下層殘留物依次用10mL、10mL乙腈按照之前步驟重復(fù)提取兩次，合并三次上清液。將上清液在40℃水浴條件下減壓蒸至近干，再加入5mL正己烷混勻，待凈化。辣椒油的主要原料辣椒粉樣品則提取過程同前，稱量0.5g辣椒粉樣品以乙腈提取，最終以5mL正己烷混勻，待凈化。

固相萃取凈化：5mL正己烷活化柱子后，加入待凈化液，棄去流出液。依次加入5mL正己烷，5mL1%乙酸乙酯正己烷，棄去流出液后再加入10mL30%乙酸乙酯正己烷，收集流出液，將洗脫液在40℃下減壓蒸餾近干，溶液以乙腈定容1.0mL，供HPLC-MS分析。

1.4.2TLC凈化

稱取0.5g辣椒油樣品，直接用2.0mL正己烷直接稀釋0.5g油脂樣品，無需乙腈提取步驟。辣椒粉樣品則需要與前述提取定容步驟一致，配置成待凈化溶液。準(zhǔn)確移取50μL樣品稀釋待凈化溶液精確地抽吸到薄層色譜點(diǎn)樣器上(加熱板溫度為50攝氏度)。以條帶上樣模式將樣品自動(dòng)打印在凈化條帶(30mm×60mm)的上樣區(qū)線上，然后將制備好的條帶插入展開缸，以正己烷/丙酮/冰乙酸(65∶35∶1)為展開劑進(jìn)行薄層色譜展開凈化。當(dāng)展開劑的前沿到達(dá)該線時(shí)，該過程結(jié)束，然后取出在平板上干燥。將蘇丹紅展開目標(biāo)區(qū)約0.5cm寬，整體裁切下轉(zhuǎn)移至細(xì)管玻璃試管，加1mL乙腈超聲提取2次，合并提取溶液，氮吹至近干，以0.2mL氨化乙腈(2%)復(fù)溶后高速離心，上清液轉(zhuǎn)移至內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中待進(jìn)樣。

1.5 LC-MS/MS分析條件

色譜柱為Phenomenex Kinetex C18(2.1mm×100mm，2.6μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為5mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)；柱溫為40℃；流速為0.4mL/min；進(jìn)樣量為2μL。梯度洗脫程序：0～0.5min，60% B；0.5～5.0min，60%～5% B；5.0～7.0min，5% B；7.0～7.1min，5%～60% B；7.1～10min，60% B。離子源為電噴霧離子源，正源模式，離子源溫度550℃，電噴霧電壓5500V，霧化氣(GS1)壓力345kPa，輔助氣(GS2)壓力379kPa，氣簾氣(CUR)壓力172kPa，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)物化合物的質(zhì)譜參數(shù)

注：* 表示定量離子。

1.6 靈敏度、線性范圍以及準(zhǔn)確性回收率實(shí)驗(yàn)

以空白裁切條帶作為基質(zhì)補(bǔ)償溶液，配制工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)溶劑配制的曲線進(jìn)行對(duì)比，確定靈敏度、線性范圍。本研究分別在2、10、200μg/kg的加標(biāo)水平上對(duì)辣椒油樣品中的加標(biāo)樣品進(jìn)行了回收率研究。LC-MS在MRM定量模式下進(jìn)行用回收實(shí)驗(yàn)保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 紙基薄層條帶分離活性的表征

紙基薄層條帶在使用之前，需對(duì)其分離活性進(jìn)行表征考查。以STAHL法作為測(cè)定薄層條帶分離活性的參考方法[14]。采用檸檬黃、亮藍(lán)和日落黃3種染料來指示當(dāng)前條帶的分離活性。從圖1中可以觀察到3種染料組分的Rf保持恒定，且3種染料化合物被完全分離，說明現(xiàn)有的紙基薄層條帶可以有效地分離指示化合物，因此，本試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了現(xiàn)有的薄層條帶保持了高分離活性。

注：a-d依次為亮藍(lán)，日落黃，檸檬黃及其3種混標(biāo)，5 mg/mL。

2.2 展開溶劑的選擇優(yōu)化

為了消除干擾和基質(zhì)化合物，將蘇丹紅4種組分集中收集到目標(biāo)區(qū)，需要選擇不同的有機(jī)溶劑及配比。由于蘇丹紅自身顏色，在平面色譜中凈化和分離的結(jié)果肉眼可見，故展開效果很直觀。選擇比較了正己烷/乙醚(6∶1)、正己烷/丙酮(65∶35)、氯仿/丙酮(9∶1)等體系，結(jié)果表明，正己烷/乙醚(6∶1)體系能有效分離辣椒油提取過程中出現(xiàn)的蘇丹紅等色素及干擾，但這4種蘇丹紅化合物分別位于2個(gè)不同的Rf位置導(dǎo)致四組分不能集中流出，從而不適合下一步同時(shí)裁切4種目標(biāo)化合物。氯仿/丙酮體系不能有效分離目標(biāo)化合物和其他干擾。正己烷/丙酮(65∶35)體系提供了較好的分離效果，4種蘇丹紅化合物集中位于同一位置，比移值約在0.75處，且四組分流出集中，展寬約0.2～0.5mm，有利于下一步裁切。該比移值與王群等[15]的研究結(jié)果一致。鑒于乙酸可以有效地降低目標(biāo)化合物的拖尾效應(yīng)[16]，在現(xiàn)有的溶劑體系中加入一定量的乙酸，最終優(yōu)化選擇正己烷/丙酮/乙酸(65∶35∶1)體系作為最終優(yōu)化的展開體系。

2.3 樣品的凈化制備

固相萃取法是樣品制備與凈化可靠的方法，但其固相萃取柱的成本和一定的有機(jī)溶劑消耗是不可避免的。近年來，快速、低有機(jī)溶劑消耗的前處理成為發(fā)展新型樣品前處理技術(shù)的一個(gè)主要趨勢(shì)。一些研究者開始使用自動(dòng)薄層色譜制備儀器對(duì)復(fù)雜的樣品進(jìn)行凈化[9,10,17]，這說明薄層層析作為樣品前處理的一種方法逐漸被主流實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可?？紤]到辣椒粉中的色素可以明顯直觀的顯示當(dāng)前待測(cè)物蘇丹紅的分離凈化效果，為此，首先測(cè)試了辣椒粉中提取物凈化分離的效果。圖2顯示了四組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣椒粉樣品空白或加標(biāo)提取液分別處于點(diǎn)狀上樣模式和條帶上樣模式下的TLC分離效果。試驗(yàn)表明4種標(biāo)準(zhǔn)化合物經(jīng)過展開分離位于條帶上寬度僅2mm左右區(qū)域，可以清晰觀察到4種蘇丹紅染料的靶區(qū)，蘇丹紅四組分相對(duì)比移值Rf均處于0.75處且相當(dāng)恒定。辣椒粉中紅色和黃色色素與蘇丹紅四種化合物(5.0μg/mL)相比移動(dòng)明顯延遲，證實(shí)了當(dāng)前TLC層析條帶對(duì)樣品組分有效的凈化和分離。這些紅色和黃色物質(zhì)根據(jù)其顏色和有關(guān)紫外檢測(cè)分析分別是葉黃素和胡蘿卜素。

注：a 空白辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅(10 μg/mL)點(diǎn)狀點(diǎn)樣分離效果；b 加標(biāo)辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅(10.0 μg/mL以及5.0 μg/mL)；c 空白辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅條帶點(diǎn)樣效果；d 加標(biāo)辣椒粉提取物和四組分蘇丹紅(5.0 μg/mL)。展開條件(正己烷/丙酮/冰乙酸=65∶35∶1)。

針對(duì)高油脂含量的辣椒油樣品，圖3顯示了混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣椒油樣品提取液分別處于點(diǎn)狀點(diǎn)樣模式和條帶點(diǎn)樣模式下的TLC分離效果。試驗(yàn)表明4種標(biāo)準(zhǔn)化合物可以與油脂中大部分的雜質(zhì)色素分開，在該板中加入的4種蘇丹紅染料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也位于同一Rf區(qū)，清晰地觀察到4種蘇丹紅染料的靶區(qū)，但其寬度有所增加，寬度擴(kuò)展到約5～7mm左右。與低油脂含量加標(biāo)樣品相比，這一結(jié)果可能是由于在高濃度的油脂干擾下待測(cè)組分在層析條帶分離效能受到影響，顯示出油脂基質(zhì)對(duì)當(dāng)前層析凈化條帶的干擾明顯，一定程度上降低了層析條帶的分離屬性。油脂中主要干擾物質(zhì)主要有多種脂類、植物甾醇、角鯊烯等[18]。本實(shí)驗(yàn)中油脂主要的干擾基質(zhì)已與4種蘇丹紅組分完全分離，而這些物質(zhì)被認(rèn)為是對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生明顯的基質(zhì)干擾。由圖3可知到位于下部的油區(qū)，目標(biāo)化合物位移至上部，但目標(biāo)區(qū)的寬度明顯大于辣椒粉提取物的寬度。

注：A：辣椒油油脂樣品點(diǎn)狀點(diǎn)樣2平行和標(biāo)準(zhǔn)2點(diǎn)樣平行，10 ug/mL，B：辣椒油油脂樣品條帶的上樣。

2.4 凈化效果的比較

固相萃取是一種有效可靠的樣品凈化手段，商業(yè)化的固相萃取柱結(jié)合有關(guān)自動(dòng)裝置可以獲得較為滿意的重現(xiàn)性和高通量。對(duì)本研究選擇的污染物蘇丹紅而言，盡管蘇丹紅染料的凈化用固相萃取盒種類繁多，但通常選擇正相SPE是因?yàn)樘K丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ在中性極性官能化聚合物[1,19]上保留較好，GB/T19681—2005使用中性氧化鋁柱可以對(duì)辣椒粉油等樣品實(shí)現(xiàn)凈化[1]。然而，在實(shí)際樣品檢測(cè)中，中性氧化鋁柱表現(xiàn)并不令人滿意，特別針對(duì)高油脂含量樣本，其洗脫流出物仍然有較多的基質(zhì)干擾物質(zhì)，其中大部分為脂類化合物。為了進(jìn)行考查本研究?jī)艋呗缘男Ч?，故采用蘇丹紅專用凈化小柱作為比對(duì)，對(duì)辣椒粉和辣椒油樣品分別進(jìn)行SPE與薄層層析凈化。比較蘇丹紅專用柱和當(dāng)前紙基薄層凈化溶液，萃取物的目視凈化效果表明，兩種凈化方法在均可以獲得澄清透明的凈化溶液，對(duì)兩種凈化方式而言，大部分的肉眼可見雜質(zhì)已被凈化洗脫完全，見圖4。然而，還有一些基質(zhì)干擾化合物不是直接可見的，因此有必要進(jìn)一步通過儀器的信號(hào)噪音比等指標(biāo)考查評(píng)估凈化效率。

注：a 辣椒粉提取液；b 辣椒粉提取液的SPE凈化效果；c 辣椒粉提取液的TLC凈化效果；d 辣椒油正己烷稀釋液；e 辣椒油的SPE凈化效果；f 辣椒油的dTLC凈化效果。

圖5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定4種蘇丹紅的總離子流圖

根據(jù)1.5中的條件建立了4種蘇丹紅的液質(zhì)聯(lián)用快速分析方法，從圖5可以看到4種蘇丹紅染料峰形良好，滿足檢測(cè)要求。為了進(jìn)一步考察SPE和TLC方法的凈化效果，對(duì)經(jīng)過上述前處理方法的辣椒油樣品進(jìn)行了LC-MS/MS分析，以基質(zhì)效應(yīng)(Martrix effect，ME)對(duì)凈化效果進(jìn)行驗(yàn)證。基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中干擾物與分析物的色譜共流出所導(dǎo)致的質(zhì)譜信號(hào)干擾現(xiàn)象，其計(jì)算公式為ME=(基質(zhì)空白溶液加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度/空白溶劑加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度)×100%。從表2可知，TLC方法能夠顯著降低4種蘇丹紅的基質(zhì)效應(yīng)，4種蘇丹紅基質(zhì)效應(yīng)范圍為67.6%～91.2%，而SPE方法仍然具有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制作用，如蘇丹紅Ⅱ達(dá)到了32.6%，顯著降低了方法的靈敏度。

表2 不同凈化方式的對(duì)蘇丹紅基質(zhì)效應(yīng)的影響

表3顯示了2種方法在處理時(shí)間、溶劑消耗方面的差異性，可以看出與常規(guī)固相萃取方法相比，當(dāng)前開發(fā)的柔性紙基凈化條帶方法具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表3 不同凈化方式的時(shí)間與溶劑消耗對(duì)比

2.5 最低定量限、線性范圍與回收率分析表現(xiàn)

根據(jù)儀器分析工作曲線斜率并結(jié)合實(shí)際表現(xiàn)，在TLC凈化方法下，辣椒油中蘇丹紅Ⅰ～Ⅲ的定量限均為1.0μg/kg，蘇丹紅Ⅳ的定量限為2.0μg/kg，線性范圍在0.002～0.5mg/kg。對(duì)當(dāng)前凈化策略下3種加標(biāo)濃度(2、10、200μg/kg)的加標(biāo)樣品進(jìn)行了回收試驗(yàn)。證明當(dāng)前分析方法可以滿足國(guó)標(biāo)方法的要求[20]。如圖6所示，加標(biāo)回收率(外標(biāo)法)在63%～85%，說明當(dāng)前分析方法能夠滿足分析要求。其中蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ回收率較低，可能與TLC條帶上吸附性較強(qiáng)有關(guān)，在今后實(shí)驗(yàn)中我們可以繼續(xù)改進(jìn)洗脫液配比，從而進(jìn)一步提升蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ的回收水平。

圖1 四種蘇丹紅染料在兩種加標(biāo)水平上回收率表現(xiàn)(n=5)

3 討論與結(jié)論

有研究人員發(fā)現(xiàn)，測(cè)定油脂樣本如辣椒油樣品時(shí)，無論使用歐盟03/99文件對(duì)蘇丹紅的檢驗(yàn)方法以及《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法-高效液相色譜法》(GB/T19681—2005)，對(duì)色譜柱的柱效影響很大。原因是植物油脂類黏度大，易于成膜，只要極少量的油脂通過色譜柱，易被柱子的微孔聚硅烷固定相吸附，造成流動(dòng)相移動(dòng)受阻，導(dǎo)致柱壓升高，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。所以，測(cè)定這些油脂樣品時(shí)，樣品數(shù)量不宜過多，且測(cè)試完后，需要長(zhǎng)時(shí)間用流動(dòng)相沖洗色譜柱，使其回復(fù)到正常柱壓[21]。而本方法建立的凈化策略可以對(duì)待測(cè)底物和油脂基質(zhì)實(shí)現(xiàn)完全分離凈化，樣品中油脂清除干凈，液相色譜柱柱壓回復(fù)良好，表明當(dāng)前方法對(duì)儀器的良好兼容性。

雖然在LC-MS或GC-MS中，應(yīng)用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際上是避免基質(zhì)效應(yīng)的最常用方法，但是通過改進(jìn)樣品制備技術(shù)以提供可靠的痕量檢測(cè)結(jié)果更為有用。當(dāng)前研究表明，作為一種快速的前處理替代方法，高效薄層色譜法顯示出良好的潛力，被證明是一種經(jīng)濟(jì)、可靠和快速的方法。通過分離-裁切-洗脫目標(biāo)化合物區(qū)，當(dāng)前開發(fā)的柔性紙基色譜對(duì)基質(zhì)的清除過程非常有效，同時(shí)也能達(dá)到高通量的清除。只需要很小的樣品體積，并且每個(gè)樣品僅需要大約1～5mL的溶劑消耗。此外，目前制造的TLC紙基條帶是具有成本效益的，根據(jù)樣品的類型的不同可以靈活的設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物的靶標(biāo)區(qū)域。對(duì)于原料辣椒粉樣品，由于萃取物校準(zhǔn)非常干凈，所以分析校準(zhǔn)幾乎可以用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。因此，可以避免基體效應(yīng)。對(duì)于高油脂類樣品，目前的凈化策略提供了更簡(jiǎn)單的制備工藝，但是這種方法還需要進(jìn)一步改進(jìn)。

通過與SPE比較，2種基質(zhì)中4種蘇丹紅化合物的平均回收率在63%～85%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，證實(shí)了有效的凈化。目前的一次性紙基薄層條帶有效地降低了基質(zhì)效應(yīng)，這項(xiàng)技術(shù)仍在發(fā)展中，目前制造的紙基板還需要進(jìn)一步改進(jìn)。但是，在痕量分析的其他領(lǐng)域，如多環(huán)芳烴或真菌毒素方面，它具有很大的改進(jìn)和擴(kuò)展?jié)摿?。所開發(fā)的帶有不同改性固定相修飾的一次性紙基條帶不僅可用于液相色譜，而且拓展應(yīng)用于氣相色譜-質(zhì)譜等儀器分析平臺(tái)，對(duì)于一些高復(fù)雜基質(zhì)樣品如水產(chǎn)品或環(huán)境樣品將是下一個(gè)挑戰(zhàn)。