基于焙烤食品的賴氨酸-葡萄糖模式反應(yīng)體系中羧甲基賴氨酸的形成規(guī)律

韓文鳳 華向美 譚興和

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院1, 長沙 410128)

(漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程系2, 漯河 462000)

(漯河出入境檢驗(yàn)檢疫局3, 漯河 462000)

(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室4, 長沙 410128)

大多數(shù)食品在熱處理過程中都會產(chǎn)生羧甲基賴氨酸(Nε-(1-Carboxymethyl)-L-lysine，CML)，尤其是含有高蛋白、高糖和高油脂類的食品如谷物類食品、乳制品和肉制品等[1-3]。CML通過食品介質(zhì)進(jìn)入人體后，可積聚于多個(gè)不同的組織器官中。達(dá)到一定數(shù)量后，會直接影響組織器官的功能，導(dǎo)致機(jī)體的病理變化。CML與人體許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，能促進(jìn)糖尿病、腎病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展和人體器官的快速衰老。食品中CML主要來源于氨基酸與還原糖的美拉德反應(yīng)，氨基酸中賴氨酸是形成CML的重要底物，CML的含量取決于蛋白質(zhì)含有的賴氨酸殘基數(shù)量[4]；還原糖由于具有易發(fā)生烯醇式轉(zhuǎn)變的還原基團(tuán)和開鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)，也成為形成CML的重要底物[5]。熱處理方式對食品中CML的形成具有非常重要的影響，蒸、煮、油炸、焙烤、微波加熱均能促進(jìn)CML的形成[6]。Goldberg等[7]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高溫處理的早餐比水果、蔬菜和牛奶等食品含有更多的CML。房紅娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理?xiàng)l件如加熱時(shí)間、加熱溫度及pH對牛血清白蛋白-葡萄糖模式體系中CML的形成具有重要影響。劉春霞[9]研究了賴氨酸-果糖模式反應(yīng)體系中底物配比、體系pH、反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對 CML形成的影響。

谷物類焙烤食品如餅干、面包和蛋糕等是目前廣受歡迎的休閑食品。周燕瓊[10]檢測發(fā)現(xiàn)焙烤類食品包括曲奇、蛋糕、面包、餅干等，CML的含量在2.3～171.2 mg/kg之間。其中牛油曲奇、芝麻蛋糕、奶香蛋糕中的CML非常高分別是156.2、153.7、171.2 mg/kg。而谷物類焙烤食品中的CML形成規(guī)律還鮮有研究。谷物類焙烤食品中的主要成分是淀粉，而淀粉是由葡萄糖分子聚合而成的，因此建立賴氨酸-葡萄糖烘焙模式反應(yīng)體系，探討反應(yīng)體系中CML形成的規(guī)律，將對有效控制谷物類焙烤食品中的CML的含量具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)利用氘代羧甲基賴氨酸(Nε-(1-Carboxymethyl)-L-lysine-D4，CML-D4)同位素內(nèi)標(biāo)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS)檢測方法，系統(tǒng)研究賴氨酸-葡萄糖模式反應(yīng)體系中CML的形成規(guī)律，考察pH值、底物濃度，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對 CML形成的影響及CML含量的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究谷物類焙烤食品加工過程中 CML的形成和抑制機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CML標(biāo)準(zhǔn)品(純度為98.0%)、CML-D4同位素內(nèi)標(biāo)(化學(xué)純度為98.0%，同位素純度為97.9%)；乙腈(質(zhì)譜純)、甲酸(質(zhì)譜純)；L-賴氨酸(純度≥98%)、D-(+)-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

OasisMCX 固相萃取柱(體積3 mL，填料質(zhì)量60 mg，填料粒徑30 μm)；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)；VacElut SPS 24 真空固相萃取裝置；N-EVAP-24圓形水浴氮吹儀；Acquity超高效液相色譜儀；UPLC BEH Amide HILIC 親水作用色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；XEVO TQ三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。

1.3 方法

1.3.1 液相檢測條件

流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；進(jìn)行梯度洗脫，洗脫參數(shù)如表1。柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；運(yùn)行時(shí)間：7 min。

表1 梯度洗脫參數(shù)

1.3.2 質(zhì)譜檢測條件

離子源：電噴霧正離子模式(ESI+)； 監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)； 毛細(xì)管電壓：3.5 kV； 錐孔電壓：20 V； 源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速：700 L/h；碰撞能量：15 V；MRM模式：CML 質(zhì)荷比(m/z)205.22—m/z84.00定量，m/z205.22—m/z130.00定性, CML-D4m/z209.00—m/z87.70定性。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列CML標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度梯度中CML-D4內(nèi)標(biāo)液的濃度均為10.0 ng/mL，渦旋均勻，UPLC-MS/MS上樣分析測定CML的含量。以響應(yīng)值-CML-D4濃度×(CML峰面積/ CML-D4峰面積)Y對CML的濃度X分別為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制內(nèi)標(biāo)法CML的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.4 檢測方法的驗(yàn)證

通過計(jì)算檢測方法的檢出限、定量限和準(zhǔn)確度來評價(jià)檢測方法的可行性。被分析物的信號強(qiáng)度(S)與基線噪音(N)的比值稱為信噪比(S/N)。一般將檢出限(LOD)定義為S/N=3也就是峰高是基線噪音高的3倍時(shí)的濃度；將定量限(LOQ)定義為S/N=10也就是峰高是基線噪音高的10倍時(shí)的濃度。一個(gè)較低濃度的被分析物溶液其峰高是基線噪音高的X倍時(shí)，則檢出限D(zhuǎn)=3C/X；式中：C代表被分析物濃度，X代表信噪比，D代表檢出限；則定量限Q=10C/X；式中：C代表被分析物濃度，X代表信噪比，Q代表定量限。

將建立的模式體系進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，分別加入濃度為1 000.0 ng/mL 3個(gè)不同體積水平的CML標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品的加標(biāo)量分別為20.0、40.0、80.0 ng/mL，每個(gè)加標(biāo)濃度均做6份平行實(shí)驗(yàn)。由于未加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品含有一定量的CML即本底值，因此，未加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品也要分析測定CML的含量，計(jì)算各加標(biāo)水平的平均回收率。

式中：P為加標(biāo)回收率；C2為樣品加入CML標(biāo)準(zhǔn)品后實(shí)測值；C1為樣品本身所含CML組分量；C0為樣品加入的標(biāo)準(zhǔn)品量。

1.3.5 溶液的配制

用H3PO4溶液(0.2 mol/L)和NaH2PO4溶液(0.2 mol/L)配制pH4.0的磷酸鹽緩沖液；NaH2PO4溶液(0.2 mol/L)和Na2HPO4溶液(0.2 mol/L)分別配制pH6.0、7.0、8.0、9.0的磷酸鹽緩沖液；Na3PO4溶液(0.2 mol/L)和Na2HPO4溶液(0.2 mol/L)分別配制pH10.0和12.0的磷酸鹽緩沖液。分別用pH4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0的磷酸鹽緩沖液配制濃度均為0.6 mol/L的賴氨酸和葡萄糖溶液。用NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.2 mol/L)配制濃度分別為1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2mol/L的賴氨酸和葡萄糖溶液。所有溶液均置于4°C環(huán)境下密封儲存。

1.3.6 賴氨酸-葡萄糖模式反應(yīng)體系的建立

分別準(zhǔn)確移取0.25 mL用特定pH磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)配制的特定濃度賴氨酸和葡萄糖溶液于反應(yīng)試管中，渦旋混合均勻。將反應(yīng)試管密封，于干熱條件下，以特定溫度加熱特定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后取出，立即置于4.0 ℃冰箱冷卻，冷卻后置于-20.0 ℃下儲存?zhèn)溆?。所有樣品均?次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 反應(yīng)終產(chǎn)物的預(yù)處理

首先將反應(yīng)試管中的反應(yīng)終產(chǎn)物定容到25.0 mL容量瓶中，從容量瓶中移取40.0 μL樣液，加入濃度為400.0 ng/mL的CML-D4同位素內(nèi)標(biāo)溶液50.0 μL然后加5%甲酸水溶液定容到2.0 mL，渦旋混合均勻。采用混合陽離子交換(Mixed cation-exchange, MCX)柱進(jìn)行固相萃取凈化。MCX固相萃取柱用3.0 mL甲醇活化和3.0 mL水平衡后，將1.0 mL樣品溶液以1～2滴/s的速度通過，待樣液完全流出后，用3.0 mL 5%甲酸水溶液淋洗，真空抽干；再用3.0 mL甲醇淋洗，真空抽干，棄去全部流出液。最后用5.0 mL 15%氨水甲醇溶液洗脫，真空抽干并用試管收集洗脫流出液。將洗脫液于40 ℃下，用氮?dú)獯祾邼饪s干燥，最后用1.0 mL水溶解試管中的殘留物，渦旋混勻，過0.22 μm聚醚砜針式過濾器于2.0 mL的進(jìn)樣小瓶中，待UPLC-MS/MS上樣分析測定反應(yīng)體系中CML的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以響應(yīng)值-CML-D4濃度×(CML峰面積/ CML-D4峰面積)Y對CML的濃度X分別為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制內(nèi)標(biāo)法CML的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)：Y=2.435 9X-1.183 1，R2=0.998 9，CML線性范圍為1.0～50.0 ng/mL，如果樣品中CML的含量較高，在進(jìn)樣分析之前樣液需要適當(dāng)稀釋，確保濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)。CML色譜圖的出峰時(shí)間為4.68 min, 定量離子的質(zhì)荷比為84.00，定性離子的質(zhì)荷比為130.00。圖2 為CML總離子流色，圖3為CML子離子流色譜圖，圖4為CML和CML-D4的一級質(zhì)譜圖，圖5為CML和CML-D4的二級質(zhì)譜圖。

圖1 CML標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 CML總離子流圖

圖3 CML子離子流圖

圖4 CML和CML-D4的一級質(zhì)譜圖

圖5 CML和CML-D4的二級質(zhì)譜圖

2.2 檢測方法的驗(yàn)證

通過UPLC-MS/MS工作軟件對1.0 ng/mL圖譜進(jìn)行自動(dòng)分析獲得S/N(X)=78.83。由檢出限D(zhuǎn)=3C/X，定量限Q=10C/X，計(jì)算得出該檢測方法中CML的LOD大約為0.038 ng/mL，LOQ大約為0.127 ng/mL；CML的加標(biāo)回收率在87.65%～94.37%之間，RSD值的范圍是4.83%～7.21%。對于方法學(xué)驗(yàn)證中的準(zhǔn)確度而言，通?？梢越邮艿幕厥章史秶?0.0%～120.0%之間[11]，說明本方法的回收率在可接受的范圍內(nèi)。可以看出本方法線性范圍寬、相關(guān)性好、檢出限和定量限低，表明該方法具有較高的靈敏度。

2.3 CML在賴氨酸-葡萄糖模式反應(yīng)體系中的形成規(guī)律

2.3.1 pH對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響

圖6 pH值對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響

圖6顯示了不同pH對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響。在底物濃度為0.3 mol/L，反應(yīng)溫度為100 ℃和反應(yīng)時(shí)間為30 min的條件下，pH從4.0增加到12.0。從圖6可以看出賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML的含量隨pH的增大而增大，即pH值為12.0的CML含量是pH為4.0含量的2.57倍。可以看出，賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系在堿性條件下比酸性條件下更容易生成CML。呈現(xiàn)這一趨勢的原因在于具有反應(yīng)活性的開環(huán)式葡萄糖的含量隨pH的增大而增大；pH也會影響賴氨酸的反應(yīng)活性，pH升高，賴氨酸的脫質(zhì)子化反應(yīng)增強(qiáng)，會產(chǎn)生活性更強(qiáng)的自由基，有利于中間產(chǎn)物的形成[12]。

2.3.2 底物濃度對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響

圖7顯示出了不同底物濃度對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響。在pH值為7.0，溫度為100 ℃和反應(yīng)時(shí)間為30 min的條件下，兩種底物濃度從0.3 mol/L增加到 2.1 mol/L。從圖7可以看出賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML的含量隨底物濃度的增大而增大，即底物濃度增大至原來的7.0倍時(shí)，CML的含量增大至原來的5.14倍?？梢灶A(yù)測在其他反應(yīng)條件不變的情況下，底物濃度在2.1 mol/L的基礎(chǔ)上繼續(xù)增大時(shí)，賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML的含量也會隨之增大，但是CML的含量增大的速度會小于底物濃度增大的速度。呈現(xiàn)這一趨勢的原因在于底物濃度增大時(shí)，會使反應(yīng)物碰撞的幾率增大，有利于反應(yīng)的進(jìn)行；但是底物濃度增大，空間位阻作用加強(qiáng)，會抑制反應(yīng)的進(jìn)行，從而導(dǎo)致CML的含量增大速度放緩。

2.3.3 反應(yīng)溫度對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中形成CML的影響

圖7顯示出了不同反應(yīng)溫度對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響。在底物濃度為0.3 mol/L，pH值為7.0和反應(yīng)時(shí)間為30 min的條件下，反應(yīng)溫度從40 ℃增加到160 ℃。從圖7可以看出賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML的含量隨反應(yīng)溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)CML的含量為46.65 mg/mol賴氨酸，當(dāng)反應(yīng)溫度升高至100 ℃時(shí)，CML的含量為317.37 mg/mol賴氨酸，達(dá)到最大值；當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，CML的含量呈下降的趨勢。溫度對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響較為復(fù)雜。反應(yīng)體系在溫度在從40 ℃升高至100 ℃的過程中，葡萄糖會發(fā)生降解、異構(gòu)和消除等反應(yīng)，這些反應(yīng)有利于CML的生成；當(dāng)反應(yīng)溫度從100 ℃繼續(xù)上升時(shí)，CML會發(fā)生降解、與賴氨酸加和，轉(zhuǎn)化為類黑精等反應(yīng)[13]。所以反應(yīng)溫度大于100 ℃時(shí)，CML的含量隨溫度的上升呈下降的趨勢。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響

圖7顯示出了不同反應(yīng)時(shí)間對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響。在底物濃度為0.3 mol/L，pH為7.0和反應(yīng)溫度為100 ℃的條件下，反應(yīng)時(shí)間從10 min增加到70 min。從圖7可以看出賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML的含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增大，可以預(yù)測在其他反應(yīng)條件不變的情況下，反應(yīng)時(shí)間在70 min的基礎(chǔ)上繼續(xù)延長時(shí)，賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML的含量也會隨之增大。呈現(xiàn)這一趨勢的原因在于在此反應(yīng)條件下，反應(yīng)時(shí)間延長，CML降解反應(yīng)速度小于其生成反應(yīng)速度，CML的含量呈繼續(xù)增大的趨勢，直至賴氨酸與葡萄糖完全反應(yīng)。

圖7 底物濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的影響

2.3.5 賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的動(dòng)力學(xué)研究

圖8顯示了賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML的含量在反應(yīng)溫度80～140 ℃的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律。從80 ℃和100 ℃的等溫曲線看，CML的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增大。在80 ℃反應(yīng)70 min 的過程中，反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)CML的含量為34.15 mg/mol賴氨酸，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長至70 min時(shí)，CML的含量為364.02 mg/mol賴氨酸，即體系中CML含量后者是前者的10.66倍；在100 ℃反應(yīng)70 min的過程中，體系中CML含量后者是前者的11.05倍。說明在低溫加熱的賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中，CML的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增大；從降解反應(yīng)的角度看，在低溫條件下CML的生成反應(yīng)速度大于其降解反應(yīng)速度。從140 ℃的等溫曲線看，在反應(yīng)初始階段CML的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增大，反應(yīng)到一定階段時(shí)CML 的含量卻呈現(xiàn)下降的趨勢。在140 ℃反應(yīng)70 min的過程中，CML的含量在20 min內(nèi)達(dá)到最大值229.08 mg/mol賴氨酸，然后CML的含量迅速降低。呈現(xiàn)這一趨勢的原因是高溫下隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，更多的CML會發(fā)生降解、與賴氨酸加和，轉(zhuǎn)化為類黑精等反應(yīng)，導(dǎo)致體系中CML形成的速度小于其消耗的速度。所以，在高溫賴氨酸-葡萄糖模式反應(yīng)體系中，CML的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈先增大后減小的趨勢。高溫體系中溫度、時(shí)間等反應(yīng)條件對CML含量的交互影響有待進(jìn)一步研究。

圖8 賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML含量的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了pH、底物濃度，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對賴氨酸-葡萄糖模式反應(yīng)體系中CML生成量的影響。pH、底物濃度和反應(yīng)時(shí)間與體系中CML含量均呈正相關(guān)；而反應(yīng)溫度對體系中CML含量的影響較為復(fù)雜，呈先增大后減小的趨勢，在底物濃度為0.3 mol/L，pH為7.0和反應(yīng)時(shí)間為30 min的條件下，反應(yīng)溫度為100 ℃時(shí)CML的含量達(dá)到最大值為317.37 mg/mol賴氨酸。對賴氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系中CML形成的動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在低溫加熱的反應(yīng)體系中，CML的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增大；而在高溫加熱的反應(yīng)體系中，CML的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈先增大后減小的趨勢。