淺談基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域中的應(yīng)用與問(wèn)題探究

鄒丹丹

【摘? ?要】 隨著ZFN、CPISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用，大量基因編輯作物生產(chǎn)出來(lái)，這種背景下，基因編輯作物的檢測(cè)及安全成為重點(diǎn)研究問(wèn)題。本文主要圍繞基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用、針對(duì)基因編輯農(nóng)作物的安全評(píng)價(jià)監(jiān)管、基因編輯農(nóng)作物的檢測(cè)等方面展開(kāi)討論，具體分析了基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，并以保障農(nóng)作物食用安全為主，加強(qiáng)基因編輯作物有關(guān)問(wèn)題的研究，促進(jìn)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域良好發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】基因編輯技術(shù);農(nóng)作物領(lǐng)域;應(yīng)用分析

Discussion on the Application and the Problem of the Gene Editing Technology in the Field of Crop

Zou Dandan

（Weihai Marine Vocational College? ?264300）

[Abstract] With the development and application of gene editing technology such as ZFN，CPISPR/Cas9， a large number of gene editing crops have been produced. Under this background， the detection and safety of gene editing crops has become a key research issue.? In this paper， the application of gene editing technology in agriculture was analyzed in detail， and the main purpose was to ensure the food safety of crops， to strengthen the research on related problems of gene editing crops， and to promote the good development of agricultural field.

[Keywords] gene editing technology; crop field; application analysis

近年來(lái)，農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了快速發(fā)展，將基因編輯技術(shù)應(yīng)用在農(nóng)作物育種上，能得到多個(gè)新的生物品種，尤其在玉米、大豆、棉花等農(nóng)作物上有著較好應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，一定程度推動(dòng)了農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)展，但是還存在一定安全問(wèn)題，要想充分利用作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，還要注重基因編輯農(nóng)作物的管理和檢測(cè)，以便能發(fā)揮基因編輯技術(shù)在研發(fā)新品種上的作用，盡可能提高農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

1? 基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1? ZFN技術(shù)

ZFN主要負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合特定的核苷酸序列，將ZFN技術(shù)應(yīng)用到作物育種中，可對(duì)植物基因進(jìn)行重新編輯。鋅指核酸酶由鋅脂蛋白和核酸酶結(jié)構(gòu)域組成，其中核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)η懈铧c(diǎn)不具有識(shí)別特異性，只有在二聚體情況下可使其具備酶活性。因此，需要對(duì)任一靶位點(diǎn)設(shè)置一對(duì)ZFN，以便形成核酸酶二聚體，從而進(jìn)行DNA鏈的切割。有研究學(xué)者采用該技術(shù)，替換掉煙草中乙酰乳酸酶基因的三個(gè)核苷酸點(diǎn)，進(jìn)而得到抗除草劑的作物[1]。另外，將ZFN技術(shù)應(yīng)用在玉米作物中，能合成磷酸酶基因，使得玉米具有抗除草劑性能，同時(shí)還能減少玉米中的肌醇六磷酸含量，提高了作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。盡管當(dāng)前ZFN技術(shù)在多種植物中取得較好運(yùn)用，但是由于鋅指單元對(duì)切割點(diǎn)識(shí)別性不高，因此在不同基因改造上的識(shí)別差異較大，限制了該技術(shù)的廣泛使用。

1.2? TALEN技術(shù)

該技術(shù)是一種基于核苷酸的編輯技術(shù)，是由核酸內(nèi)切酶和DNA結(jié)構(gòu)域共同組成的，其中DNA結(jié)構(gòu)域主要是由多個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的，重復(fù)序列能識(shí)別相應(yīng)的堿基。TALEN技術(shù)運(yùn)用原理為：結(jié)合靶位點(diǎn)兩端的序列設(shè)置一對(duì)TALEN，與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合后，兩個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)合起到形成二聚體，在切割DNA鏈后可完成基因編輯。有學(xué)者將該技術(shù)運(yùn)用到水稻中，破壞了細(xì)菌性病原菌效應(yīng)蛋白在作物基因組上的位點(diǎn)，進(jìn)而提高了水稻抗百葉枯病。另外，在這一技術(shù)作用下，還能破壞水稻甜菜堿乙醛脫氫酶結(jié)合位點(diǎn)，能起到提高水稻品質(zhì)的作用。而將該轉(zhuǎn)基因技術(shù)運(yùn)用到小麥育種中，能得到抗性較強(qiáng)的小麥，相對(duì)于傳統(tǒng)育種技術(shù)來(lái)講有明顯進(jìn)步。

1.3? CRISPR/Cas9技術(shù)

這一技術(shù)能對(duì)作物基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯，能得到預(yù)期的作物品種。CRISPR屬于一種免疫系統(tǒng)，能抵抗外部DNA的侵入。由于Cas基因序列不同，因此通常將免疫系統(tǒng)分成三類(lèi)。研究學(xué)者通過(guò)對(duì) 類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)行改造，能促使CRISPR/Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成有著特異性的核酸酶，能后和靶位點(diǎn)結(jié)合并切割DNA鏈。實(shí)際運(yùn)用免疫系統(tǒng)時(shí)，首先形成需要的RNA鏈，之后和病毒的DNA節(jié)點(diǎn)進(jìn)行互補(bǔ)。相較于其他基因編輯技術(shù)來(lái)講，CRIAPR技術(shù)操作較簡(jiǎn)單，在定向基因編輯方面有著較好運(yùn)用。實(shí)踐表明，這一技術(shù)在高粱、玉米、小麥、甜橙、煙草等作物中有較好應(yīng)用性，有著巨大發(fā)展?jié)摿?。如有學(xué)者對(duì)玉米中的酶基因建立免疫系統(tǒng)載體，測(cè)序結(jié)果表明基因鏈上出現(xiàn)不同程度的缺失，從而提升了玉米品質(zhì)。在農(nóng)作物生產(chǎn)上，借助免疫系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的整合，是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的有效途徑。

2? 針對(duì)基因編輯農(nóng)作物的安全評(píng)價(jià)監(jiān)管

2.1? 安全性評(píng)價(jià)方法

在轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)方面，主要是針對(duì)基因編輯方式進(jìn)行檢測(cè)基因。轉(zhuǎn)基因作物主要發(fā)生堿基缺失和替換等變化，對(duì)突變結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，可掌握作物安全與否。當(dāng)前主要采用以下檢測(cè)技術(shù)：一是PCR-RE技術(shù)，這一分析方法運(yùn)用原理為，考慮某種包括特定內(nèi)切酶的切割點(diǎn)，確定好靶位點(diǎn)，如果位點(diǎn)出現(xiàn)突變時(shí)，將朝著目標(biāo)區(qū)域發(fā)生PCR擴(kuò)張，并且該位點(diǎn)能被特異性?xún)?nèi)切酶切割。但是缺失這類(lèi)酶基因的位點(diǎn)，不能被識(shí)別[2]。從這角度出發(fā)，能有效區(qū)分基因編輯位點(diǎn)與未編輯位點(diǎn)。二是T7EI分析技術(shù)，T7EI內(nèi)切酶能斷開(kāi)錯(cuò)配堿基上磷酸二酯鍵，造成DNA鏈的斷裂。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在高溫環(huán)境下出現(xiàn)變形，之后逐漸降溫時(shí)，突變的靶位點(diǎn)將進(jìn)行隨機(jī)配對(duì)，并且最終的結(jié)構(gòu)將被酶基因切割。如不出現(xiàn)突變時(shí)，位點(diǎn)進(jìn)行正常配對(duì)，不會(huì)被核酸酶切割，從上述區(qū)別著手，可監(jiān)測(cè)出農(nóng)作物基因序列。

2.2? 潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法

在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物的潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)時(shí)，主要針對(duì)基因編輯脫靶情況進(jìn)行檢測(cè)，在PCR擴(kuò)增的情況下，實(shí)施測(cè)序驗(yàn)證。目前使用的CPISPR-P算法，能預(yù)估可能出現(xiàn)的脫靶位點(diǎn)，之后根據(jù)可能性高低，建立起脫靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站。在這一基礎(chǔ)上，有學(xué)者開(kāi)發(fā)了2.0數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，同時(shí)能為脫靶預(yù)測(cè)提供依據(jù)。隨著測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，已經(jīng)解析了較多植物的基因組序列。針對(duì)基因編輯后的農(nóng)作物進(jìn)行測(cè)序，之后對(duì)比目標(biāo)區(qū)域與受體的基因系列，能檢測(cè)出潛在脫靶位點(diǎn)及基因編輯狀態(tài)。上述測(cè)序方法在判斷脫靶位點(diǎn)上有較好應(yīng)用，但是該技術(shù)使用時(shí)還受到參考基因的限制，需要在已有技術(shù)基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)處理。

2.3? 基因編輯農(nóng)作物的檢測(cè)

2.3.1? 傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)技術(shù)? ? 以往的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)是在DNA基礎(chǔ)上進(jìn)行的，通過(guò)應(yīng)用篩選PCR、設(shè)計(jì)特異性PCR、基因特異性PCR等方法的運(yùn)用，能對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的插入位點(diǎn)及外源基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用PCR可達(dá)到檢測(cè)的目的。我國(guó)檢疫部門(mén)便借助上述技術(shù)確定了轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，能有效避免不達(dá)標(biāo)的轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入市場(chǎng)中。如2013-2014年，我國(guó)退運(yùn)了大量含轉(zhuǎn)基因組分的進(jìn)口玉米。

2.3.2? 基因編輯作物檢測(cè)技術(shù)? ? 不同種類(lèi)的基因編輯作物，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法不同。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)無(wú)法應(yīng)用在全部的作物檢測(cè)中，利用單粒種子作為樣本，可對(duì)第1代、第2代基因編輯作物實(shí)施有效檢測(cè)，而在第3代、第4代的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中應(yīng)用相對(duì)復(fù)雜。插入的元件基因可能是植物自身的，只檢測(cè)插入元件不能保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。這時(shí)可通過(guò)檢驗(yàn)插入位點(diǎn)的序列情況，判斷作物是否含有轉(zhuǎn)基因成分[3]。對(duì)于基因編輯作物來(lái)講，主要是通過(guò)基因插入、刪除和堿基突變等，達(dá)到作物育種的目的，增加檢測(cè)難度，還需要針對(duì)不同類(lèi)型的基因編輯作物采取針對(duì)性檢測(cè)。如對(duì)于定點(diǎn)替換荷核苷酸位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因作物，將這類(lèi)檢測(cè)看作是位點(diǎn)突變檢測(cè)，采用熒光PCR等方法能完成檢測(cè)任務(wù)。隨著高通量序列檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因作物的安全檢測(cè)提供了技術(shù)保障，能很好區(qū)分基因編輯作物和自然作物，有利于獲取更多檢測(cè)信息。

3? 結(jié)論

綜上所述，隨著基因編輯技術(shù)的開(kāi)發(fā)，大量基因編輯作物逐漸出現(xiàn)，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)展的同時(shí)，還面臨一定問(wèn)題。當(dāng)前一些農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化體系還不完善，無(wú)法充分發(fā)揮基因編輯技術(shù)運(yùn)用價(jià)值。因此，有必要加大對(duì)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域基因編輯技術(shù)應(yīng)用及安全監(jiān)管的研究，探索基因編輯技術(shù)應(yīng)用路徑，確?；蚓庉嫾夹g(shù)應(yīng)用可靠性和有效性，通過(guò)加大基因編輯作物監(jiān)管力度，使得基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物育種方面發(fā)揮積極作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張青霞.CRISPR-Cas9系統(tǒng)在農(nóng)作物中的研究進(jìn)展[J].山西農(nóng)經(jīng)，2019（01）：111-112.

[2] 吳龍芬.依托“七大農(nóng)作物育種”專(zhuān)項(xiàng)實(shí)施，推進(jìn)基因編輯技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2018，20（08）：155.

[3] 郝麗芬，房永雨冰.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及在農(nóng)作物品種改良研究中的應(yīng)用[J].北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，45（03）：29-35.