油橄欖雜交子代生長(zhǎng)與生理性狀變異研究

李金花 張曉艷 李 娜 趙海云 張建國(guó)

( 1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；

2. 國(guó)家林業(yè)和草原局隴南市國(guó)家油橄欖良種基地，隴南市武都區(qū)林業(yè)局油橄欖研究開發(fā)中心，甘肅 隴南 746000)

油橄欖（Olea europaea）原產(chǎn)于地中海地區(qū)，是世界著名優(yōu)質(zhì)木本油料兼果用樹種，利用其鮮果經(jīng)冷榨而成的橄欖油具有營(yíng)養(yǎng)保健功能。目前油橄欖已在40多個(gè)國(guó)家引種種植，在長(zhǎng)期的引種馴化和栽培歷史中形成了1 200多個(gè)品種[1]。我國(guó)自20世紀(jì)60年代初期開始大規(guī)模地引種油橄欖，經(jīng)過數(shù)十年努力，已在9個(gè)省市區(qū)引種推廣，尤以甘肅、四川、云南發(fā)展規(guī)模最大，引進(jìn)品種超過150個(gè)，但在大多數(shù)地區(qū)沒有形成生產(chǎn)力，主要原因是我國(guó)土壤和氣候條件與原產(chǎn)地不同，相近氣候和土壤因子的差異，影響了油橄欖生長(zhǎng)發(fā)育[2-4]。因此，單從品種選擇和栽培技術(shù)上改善和提高產(chǎn)量是困難的，必須加強(qiáng)油橄欖育種工作，以引進(jìn)的油橄欖遺傳資源為基礎(chǔ)，創(chuàng)造和選育適應(yīng)我國(guó)氣候和土壤特點(diǎn)的油橄欖新品種[5-8]。油橄欖以異花授粉為主，大多數(shù)品種為自交不親和，即使存在部分自交親和性，但自孕率最多只有0～3%[4,9-10]。油橄欖品種通常來源于自然授粉種子的實(shí)生苗，有相當(dāng)數(shù)量都是品種間自然雜種，在遺傳性上具有極大的雜合性，存在豐富的遺傳變異，奠定了選擇育種的基礎(chǔ)[11]。實(shí)生選優(yōu)是油橄欖育種的主要途徑之一，對(duì)表型變異豐富的實(shí)生個(gè)體的選擇目標(biāo)主要為適應(yīng)性（不良條件的抗性）、豐產(chǎn)性（結(jié)果早晚和多少）和果實(shí)品質(zhì)（含油率和大?。渲泄麑?shí)品質(zhì)須在開花結(jié)實(shí)后才能進(jìn)行評(píng)價(jià)[12-13]。然而，在自然條件下油橄欖實(shí)生樹的童期長(zhǎng)達(dá)15～20 a，成為了影響育種工作效率的瓶頸[10,14-16]。為了加速育種進(jìn)程，如何縮短童期、提早開花結(jié)果，選育短童期油橄欖新品種，一直是國(guó)內(nèi)外油橄欖育種者關(guān)注的問題。

國(guó)外油橄欖育種起步較早，從童期葉片形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)[16-20]、生理生化特征[21-22]、分子生理機(jī)制[23-25]和生長(zhǎng)參數(shù)[26-29]等方面進(jìn)行了大量研究，并發(fā)現(xiàn)親本基因型[30-33]和實(shí)生樹早期生長(zhǎng)勢(shì)[27,31,34]影響實(shí)生樹的童期長(zhǎng)短。油橄欖不同品種的童期長(zhǎng)短不同，不同品種子代實(shí)生樹的童期長(zhǎng)短與其親本的童期長(zhǎng)短相關(guān)[30,33]，特別是與其母本的童期長(zhǎng)短有關(guān)[35]。實(shí)生樹的開花結(jié)實(shí)，必須具備足夠生長(zhǎng)量即營(yíng)養(yǎng)積累，因此通過提供適宜環(huán)境條件來提高生長(zhǎng)勢(shì)，可以縮短童期，而樹高和地徑被認(rèn)為評(píng)價(jià)生長(zhǎng)勢(shì)的主要參數(shù)[26,33-34]。光合作用作為能量主要來源的途徑，從根本上影響著植株的生長(zhǎng)勢(shì)，光合作用和效率亦可作為油橄欖育種的選擇目標(biāo)[7,36]。

本研究以‘城固32’、‘鄂植8’、‘萊星’和‘皮削利’4個(gè)油橄欖品種雜交F1代2年生實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)苗高、地徑、Ⅰ級(jí)分枝數(shù)、Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)、主干節(jié)間長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀和凈光合速率（Pn）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光合性能指數(shù)（PI）等生理性狀進(jìn)行遺傳變異分析、相關(guān)分析及主成分分析分析，研究了不同雜交組合內(nèi)性狀變異系數(shù)，對(duì)其變異來源進(jìn)行估算，旨在綜合評(píng)價(jià)和選擇生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的實(shí)生苗，為短童期實(shí)生苗的早期選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

在甘肅省隴南市武都區(qū)大灣溝油橄欖示范園（104°55′E，33°24′N）內(nèi)選擇‘城固 32’、‘鄂植8’、‘萊星’、‘皮削利’4個(gè)品種為親本，每個(gè)品種選取樹齡一致、生長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量俱佳的結(jié)果樹3株。在春季開花期利用人工雜交袋法[4]進(jìn)行完全雙列雜交試驗(yàn)，3次重復(fù)，秋季9月中旬收集果實(shí)，并采集了4個(gè)品種自由授粉的果實(shí)，經(jīng)果肉脫離、清洗處理后獲得種子。

在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院（北京）（116°14′E，40°00′N）溫室將種子破殼后獲得種仁，播種在10 cm×13 cm穴盤中，共獲得62株播種苗（表1），待生長(zhǎng)8個(gè)月后，移栽到24 cm×30 cm營(yíng)養(yǎng)缽中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)為V（腐殖質(zhì)土）∶V（珍珠巖）=8∶1的混合物。

表 1 不同油橄欖品種的雜交子代實(shí)生苗數(shù)量及編號(hào)Table 1 The number of seedlings from crossing between O. europaea varieties

1.2 性狀測(cè)定

于2014年生長(zhǎng)季節(jié)8月，測(cè)定2年生雜交子代實(shí)生苗木苗高、地徑、Ⅰ級(jí)分枝數(shù)及總長(zhǎng)和主干節(jié)間長(zhǎng)。于8月24—26日上午9：00—11：00，采用Li-6400光合儀（ LI-COR，美國(guó)）測(cè)定Pn。葉片溫度為25～30 ℃，光強(qiáng)為900～1 100 μmol/（m2·s），流速為 3×105μmol/s。同時(shí)利用 Handy PEA型植物效率儀（Hansatech，英國(guó)）測(cè)定葉綠素?zé)晒馓匦?，測(cè)定前采用葉子夾進(jìn)行20 min遮光處理，以保證葉子完全進(jìn)入暗適應(yīng)狀態(tài)，記錄Fv/Fm、PI。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和校對(duì)。利用SPSS 18.0和對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行性狀變異分析、相關(guān)性分析和主成份分析。按公式（1）計(jì)算變異系數(shù)（C）。利用WinNC 1.0[37]，按方差分析線性模型（公式（2））進(jìn)行方差分析。

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)差，X為某一總體指標(biāo)的平均值。

式中：Yijk為第i個(gè)母本下第j個(gè)父本的第k個(gè)觀測(cè)值。μ為群體平均值；Fi為母本效應(yīng)；Mij為母本下的父本效應(yīng)；eijk為機(jī)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 子代實(shí)生苗的性狀變異

油橄欖子代實(shí)生苗生長(zhǎng)與生理參數(shù)的變異分析結(jié)果見表2。

表 2 油橄欖子代實(shí)生苗生長(zhǎng)與生理參數(shù)的變異分析Table 2 Variation analysis of growth and physiological parameters of O. europaea seedlings

由表2可知，62株實(shí)生苗生長(zhǎng)性狀和生理性狀均存在變異，苗高均值為85.23 cm，最大的是鄂植8×萊星子代28b（149.6 cm），是最小的萊星自由授粉子代35e（16.4 cm）的9倍。地徑均值為0.612 cm，最大的是鄂植8自交子代12a（0.891 cm），是最小的城固32×萊星子代9b（0.341 cm）的2.6倍。1級(jí)分枝總長(zhǎng)均值為97.48 cm，最大的是萊星自交子代34b（248.3 cm），是最小的萊星×鄂植8子代46g（4.6 cm）的54倍；分枝數(shù)均值為18.64，最多的是萊星自交子代34b（38個(gè)），5b、34c、34d無側(cè)枝；主干節(jié)間長(zhǎng)均值為1.83 cm，最大的是28a（2.75 cm），是最小的46g（0.35 cm）的7.8倍；Pn最大的是42a（13.03），是最小的6e（1.71）的13倍；Fv/Fm最大的是28e（0.853），是最小的46g（0.725）的1.5倍；PI最大的是46d（5.419），最小的是35f（0.33）。除Fv/Fm的變異系數(shù)較小之外，各生長(zhǎng)性狀均存在較大的變異系數(shù)，Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)變異最大為0.617。由此可知，油橄欖雜交子代實(shí)生苗的生長(zhǎng)性狀存在較大的變異，而子代實(shí)生苗的Fv/Fm變異不大，無選擇的意義。

2.2 子代實(shí)生苗性狀的方差分析

由表3可知，苗高、地徑、主干節(jié)間長(zhǎng)、Pn、Fv/Fm和PI的母本間和母本內(nèi)父本間差異均不顯著，Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)和分枝數(shù)的母本間差異不顯著，但母本內(nèi)父本間差異顯著（P＜0.05）。由此可知，母本基因型不是性狀差異的主要來源，母本內(nèi)父本基因型是Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)及和分枝數(shù)變異的主要來源，對(duì)Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)和分枝數(shù)變異的影響主要源于父本基因型或者是父本與母本基因型之間交互效應(yīng)。

表 3 油橄欖子代實(shí)生苗生長(zhǎng)與生理性狀的方差分析Table 3 One-way ANOVA of growth and physiological parameter of O. europaea seedlings

2.3 子代實(shí)生苗生長(zhǎng)與生理性狀的相關(guān)關(guān)系

由表4可知，子代實(shí)生苗各生長(zhǎng)性狀間相關(guān)關(guān)系顯著（P＜0.05），且為正相關(guān)，苗高和主干節(jié)間長(zhǎng)相關(guān)性最高（r=0.839），生長(zhǎng)性狀與Fv/Fm、PI間相關(guān)關(guān)系不顯著。由此表明，生長(zhǎng)勢(shì)不僅僅表現(xiàn)在苗高和地徑上，Ⅰ級(jí)分枝數(shù)及分枝總長(zhǎng)、主干節(jié)間長(zhǎng)均可作為評(píng)價(jià)實(shí)生苗生長(zhǎng)勢(shì)的參數(shù)。光合作用作為植物獲得能量的主要渠道，Pn除了與Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)間相關(guān)性不顯著外，與其他性狀間相關(guān)性均呈極顯著（P＜0.05）。由此可知，在油橄欖子代實(shí)生苗早期選擇時(shí)，不僅僅以苗高和地徑為生長(zhǎng)勢(shì)的早期選擇指標(biāo)，Ⅰ級(jí)分枝數(shù)及分枝總長(zhǎng)、主干節(jié)間長(zhǎng)和Pn均可以作為早期選擇性狀指標(biāo)。

表 4 油橄欖子代實(shí)生苗生長(zhǎng)與生理性狀相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between growth and physiological traits of O. europaea seedlings

2.4 油橄欖不同雜交子代生長(zhǎng)與生理性狀的主成分分析

由圖1可知，以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)剖分出2個(gè)主成分（主成分方程見表5），第1主成分在各性狀上的載荷分別為0.916、0.737、0.576、0.579、0.849和0.863，除Ⅰ級(jí)分枝數(shù)和分枝總長(zhǎng)外均大于0.7。由此表明，第1主成分是苗高、地徑、主干節(jié)間長(zhǎng)和Pn的綜合反應(yīng)指標(biāo)；第2主成分則主要為Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)和分枝數(shù)的反應(yīng)指標(biāo)，載荷值分別為0.754和0.744。第1、2主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)81.88%，在一定程度上能夠說明油橄欖子代實(shí)生苗的生長(zhǎng)勢(shì)。

圖 1 油橄欖子代實(shí)生苗生長(zhǎng)和生理性狀主成分分析碎石Fig. 1 Crushed stone diagram of growth and physiological traits of O. europaea seedlings

表 5 油橄欖子代實(shí)生苗生長(zhǎng)性狀和生理性狀主成分方程Table 5 Principal component equation for growth traits andphysiological traits of O. europaea seedlings

利用第1、2主成分繪制散點(diǎn)圖（圖2），生長(zhǎng)勢(shì)和發(fā)枝表現(xiàn)較優(yōu)良的實(shí)生苗為5a、7a、9a、12a、15a、24a、24b、28d、34a、34b、35d、42a、43c、43e、44a、45a、46a、46c、46g等19個(gè)，生長(zhǎng)勢(shì)不顯優(yōu)勢(shì)但發(fā)枝表現(xiàn)較優(yōu)良的為4a、35c、46d、42b等4個(gè)。生長(zhǎng)勢(shì)較差，但發(fā)枝表現(xiàn)優(yōu)良的為35h、15e、43g、39a、35e和46f等6個(gè)。生長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)較優(yōu)，但發(fā)枝表現(xiàn)不顯優(yōu)勢(shì)的為 35a、37a、38a、43d、43h、40a。23a、15c、46b、44b、28a等11個(gè)。生長(zhǎng)勢(shì)較優(yōu)但發(fā)枝表現(xiàn)較差的是15d、27a、28b、28c、35b、15b、43f等7個(gè)。生長(zhǎng)勢(shì)和發(fā)枝表現(xiàn)均不顯優(yōu)勢(shì)的為43a、9b、43b、46e、41a、35f、28e等7個(gè)。生長(zhǎng)勢(shì)和發(fā)枝表現(xiàn)均較差的是5b、34d、34c、27b、14a、28f、24c、35g等8個(gè)。綜上所述，實(shí)生苗優(yōu)良單株為 5a、7a、9a、12a、15a、24a、24b、28d、34a、34b、35d、42a、43c、43e、44a、45a、46a、46c、46g、43a、9b、43b、46e、41a、35f、28e、15d、27a、28b、28c、35b、15b、43f、35a、37a、38a、43d、43h、40a、23a、15c、46b、44b、28a等44個(gè)。

圖 2 油橄欖實(shí)生苗生長(zhǎng)與生理參數(shù)主成分載荷圖Fig. 2 Main component load diagram of growth and physiological parameters of O. europaea seedlings

3 結(jié)論與討論

油橄欖是地中海的油用和果用樹種，我國(guó)的自然條件與油橄欖原產(chǎn)地具有較大差異，雖然引入的品種在我國(guó)已經(jīng)引種成功，但對(duì)我國(guó)的氣候和土壤適應(yīng)性表現(xiàn)出差異，因此適于我國(guó)生態(tài)環(huán)境的品種是油橄欖育種的重點(diǎn)。在油橄欖育種中對(duì)實(shí)生苗進(jìn)行單株選優(yōu)，我國(guó)選育出‘中山24’、‘城固32’、‘鄂植8’等優(yōu)良實(shí)生品種，美國(guó)由墨西哥引種油橄欖選育出實(shí)生品種‘Mission’[5]。目前，油橄欖育種目標(biāo)是選擇童期短、矮化、抗病的品種。本研究目的是選擇理論上童期短的子代實(shí)生苗，選擇出的優(yōu)良單株有44株，短童期的選擇率為70.9%，明顯提高了供試群體的均值。此外選擇了一些生長(zhǎng)勢(shì)不顯優(yōu)勢(shì)但發(fā)枝能力表現(xiàn)較優(yōu)的單株，如4a、35c、46d、42b，矮化單株的選擇率為6.5%。這些單株的苗高、地莖處于中等水平，但是側(cè)枝發(fā)枝明顯且生長(zhǎng)旺盛，可以考慮作為矮化品種。對(duì)于生長(zhǎng)勢(shì)特別弱的侏儒苗木，一般不能成型，沒有入選價(jià)值[4]，則可以淘汰掉，淘汰率達(dá)33.9%。

本研究實(shí)試材料來自溫室，與大田條件具有一定差異，實(shí)際的選擇效果還未可知，必須經(jīng)大田試驗(yàn)的篩選和檢驗(yàn)。以苗高和地徑作為實(shí)生苗生長(zhǎng)勢(shì)指標(biāo)只適用于溫室，不適于田間試驗(yàn)篩選[31]，而利用田間試驗(yàn)對(duì)油橄欖生長(zhǎng)勢(shì)相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)評(píng)價(jià)油橄欖生長(zhǎng)勢(shì)的最適參數(shù)主要包括頂莖、第2側(cè)枝數(shù)、最長(zhǎng)側(cè)枝節(jié)間長(zhǎng)、主干的冠幅、第2側(cè)枝角[34]。因此，通過田間試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的選擇時(shí)，應(yīng)選用這5個(gè)參數(shù)作為評(píng)價(jià)生長(zhǎng)勢(shì)的指標(biāo)，但是否可以作為評(píng)價(jià)童期長(zhǎng)短的直接依據(jù)，有待進(jìn)一步鑒定[38]。最新研究表明[33]，相對(duì)于子代生長(zhǎng)勢(shì)，母本基因型對(duì)油橄欖童期的影響更為顯著，對(duì)于不同基因型母本，子代實(shí)生苗苗高的選擇指標(biāo)不應(yīng)相同。由此可知，進(jìn)行子代早期選擇時(shí)，應(yīng)先考慮到母本基因型的影響，然后在母本基因型前提下選擇生長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)優(yōu)良的實(shí)生苗單株。然而，對(duì)于母本基因型前提下子代的生長(zhǎng)勢(shì)選擇，不同基因型母本應(yīng)采用苗高的哪些具體指標(biāo)尚未有研究。

本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)生苗在母本間生長(zhǎng)性狀差異不顯著，而母本內(nèi)父本間Ⅰ級(jí)分枝總長(zhǎng)和分枝數(shù)差異性顯著，這些差異性是由于父本還是母本與父本的交互作用影響尚未可知。因此，在開展油橄欖雜交育種時(shí)，是否應(yīng)考慮注重雜交組合的選擇。對(duì)油橄欖子代實(shí)生苗單株間Fv/Fm差異性不大，無選擇的意義，而Pn與苗高、地徑、分枝數(shù)和節(jié)間長(zhǎng)之間表現(xiàn)出顯著正相關(guān)，說明Pn可作為生長(zhǎng)勢(shì)的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，而在生產(chǎn)實(shí)踐中，不便于測(cè)定子代單株的光合作用，適宜于將Ⅰ級(jí)分枝數(shù)等形態(tài)指標(biāo)作為選擇指標(biāo)[39]。因此，在培育油橄欖短童期新品種的過程中，可先考慮將短童期品種作為母本，再?gòu)钠渥哟羞x擇生長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良單株，結(jié)合適宜的栽培和修剪方法，最大化地縮短童期，提高油橄欖栽培效益[28,39]。

致謝：本項(xiàng)研究工作中得到了隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司的大力支持和幫助，碩士研究生秦倩參與了部分測(cè)定工作，特此致謝。