紫果西番蓮愈傷組織誘導(dǎo)分化及不定芽增殖研究

王亞楠 張湛儀 趙李?yuàn)?余俊玲 汪夢(mèng)婷 蔡年輝 唐軍榮 許玉蘭

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；3. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；4. 奈曼旗林業(yè)局奈曼旗沙日浩來林業(yè)工作站，內(nèi)蒙古 通遼 028300)

西番蓮（Passiflora caerulea）是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora）的一種熱帶草質(zhì)或半木質(zhì)藤本植物，又名雞蛋果、百香果、計(jì)時(shí)果[1]。西番蓮屬植物有400多種，原產(chǎn)南美洲的巴西至阿根廷一帶[2]。我國主要分布在臺(tái)灣、廣東、福建、廣西、浙江、四川等省區(qū)。果實(shí)供食用的西番蓮主要有6種：紫果西番蓮（P. edulis）、黃果西番蓮（P. edulisf.flavicarpa.）、樟葉西番蓮（P. laurifolia）、大果西番蓮（P. quadrangularis）、甜果西番蓮（P.1igularis）和香蕉西番蓮（P. mollissima），目前商業(yè)栽培種主要是紫果西番蓮和黃果西番蓮[3]。

西番蓮果實(shí)為漿果，味道鮮美，富含各種營養(yǎng)成分，在國際飲料市場(chǎng)占有重要地位，素有“飲料之王”的美譽(yù)，且根、莖、葉、花還可入藥[3]。近年來國際市場(chǎng)對(duì)西番蓮果汁的需求每年以15%～20%的速度增長，大有供不應(yīng)求之勢(shì)。除果汁外，果汁粉、蜜餞、口香糖等產(chǎn)品也深受歡迎[4]。而我國西番蓮種質(zhì)資源相對(duì)缺乏，生產(chǎn)中存在較多問題，如品種單一，產(chǎn)量低，品質(zhì)、抗病性差，影響了西番蓮種植業(yè)和加工業(yè)的發(fā)展[5]。紫果西番蓮果汁味道芬芳，其獨(dú)特的芳香味是由60多種揮發(fā)性化合物組成，有脂類、醇類、醛類、酮類、萜烯類和其他雜類化合物[6]。但在紫果西番蓮的果實(shí)中，果汁（漿）占果質(zhì)量的45%～53%，種子占果質(zhì)量的5%～20%[6]。果實(shí)中大量的種子，會(huì)影響食用的口感，也會(huì)增加果實(shí)的加工成本。因此，在今后西番蓮的品種選育中，果實(shí)中少籽或無籽也是品種選育的一個(gè)重要目標(biāo)。

基于植物組織培養(yǎng)開展的倍性育種，是人工獲得三倍體的最有效途徑，但該項(xiàng)工作的首要關(guān)鍵，就是要有一個(gè)穩(wěn)定高效的植株再生體系。目前關(guān)于西番蓮的組培研究中，?？返萚7]、李紅艷等[8]均利用西番蓮的幼嫩帶腋芽莖段誘導(dǎo)出了芽；豐鋒等[9]利用西番蓮的子房、柱頭、幼胚誘導(dǎo)出愈傷組織，但是通過種子離體培養(yǎng)得到子葉來建立西番蓮離體快繁體系的僅有史沉魚等[10]，且愈傷組織誘導(dǎo)率及芽增殖率均較低，植株再生體系的再生率不高。Sanchez等[11]對(duì)西番蓮屬植物的葉綠體DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析（RFLP），結(jié)果顯示，西番蓮種間存在廣泛的遺傳變異，但是基于離體快繁技術(shù)培育篩選優(yōu)良品種，并通過酶分解得到原生質(zhì)體，繼續(xù)培養(yǎng)得到再生植株，為西番蓮遠(yuǎn)緣雜交，克服有性雜交不親和性提供手段，從而使引進(jìn)優(yōu)良西番蓮的抗性基因成為可能[2]?；诖?，為了建立高效的紫果西番蓮的植株再生體系，以紫果西番蓮種子離體培養(yǎng)的子葉為實(shí)驗(yàn)材料，研究西番蓮的植株再生體系，為西番蓮優(yōu)良家系的快速繁殖、倍性育種、基因工程以及遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 無菌材料獲得

將紫果西番蓮的種子經(jīng)80%濃硫酸浸泡3.5 h使其碳化部分種皮，然后在無菌操作臺(tái)分別用75%的乙醇消毒30 s和0.1%的升汞進(jìn)行消毒8 min，消毒結(jié)束后，無菌水沖洗3～4次，最后去除剩余種皮，將完整的種子接種在培養(yǎng)基上，30 d后取其展開的子葉作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)

將葉片切成1.5 cm×1.5 cm左右的大小方塊，在垂直葉脈處輕輕劃出傷口，然后接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。選擇MS為基本培養(yǎng)基，分別附加瓊脂3.8 g/L，蔗糖30 g/L，pH為5.9±0.1，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素TDZ（噻苯?。?.5、2.0 mg/L），生長素2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），經(jīng) 121 ℃ 高溫滅菌20 min，共8個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5瓶，每瓶接入2個(gè)材料。

1.3 不定芽誘導(dǎo)

將誘導(dǎo)出的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至不定芽分化培養(yǎng)基中。以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加瓊脂3.8 g/L，蔗糖30 g/L，pH為5.9±0.1，經(jīng)121 ℃高溫滅菌20 min，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素TDZ（1.0、1.5、2.0 mg/L），生長素2,4-D為0.5 mg/L，共4個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5瓶，每瓶接入2個(gè)材料。

1.4 不定芽增殖

以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加瓊脂4.0 g/L，蔗糖 30 g/L，pH為5.9±0.1，經(jīng) 121 ℃ 高溫滅菌20 min，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA（6-芐氨基嘌呤）（1.0、2.0、3.0 mg/L），生長素IAA（吲哚-3-乙酸）（0.1、0.3、0.5 mg/L）。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（表1、表2），共9個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5瓶，每瓶接入2個(gè)材料。

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室的溫度（25±2） ℃，光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx。

表 1 實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the experiment

表 2 6-BA和IAA正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal test design of 6-BA and IAA

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel表格對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方差分析、多重比較（Duncan’s法）以及極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長素與分裂素不同配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在不同2,4-D與TDZ質(zhì)量濃度配比的各個(gè)培養(yǎng)基上，西番蓮愈傷組織誘導(dǎo)呈顯著差異。葉片接進(jìn)培養(yǎng)基7 d后傷口處開始膨大，10 d開始有淡綠色愈傷組織點(diǎn)出現(xiàn)，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）。由結(jié)果可以看出，處理2的誘導(dǎo)率與處理1、5、6、8之間存在顯著差異，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的是處理2，為73.33%，愈傷組織為黃綠色，較緊實(shí)，量比較多，并有不定芽的分化，誘導(dǎo)率最低的為處理5，未見有愈傷組織，且在30 d統(tǒng)計(jì)的時(shí)候，葉片出現(xiàn)褐化死亡。在TDZ濃度為0.5 mg/L時(shí)，隨著2,4-D濃度的增高，愈傷組織誘導(dǎo)率也增加，在2,4-D為1.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)TDZ濃度提高到2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率也是先上升后下降。由結(jié)果還可以看出，當(dāng)TDZ濃度從0.5 mg/L提高到2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率整體出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，說明高濃度TDZ可能會(huì)抑制愈傷組織的形成，并且形成的愈傷組織均為黃色偏白色，繼續(xù)培養(yǎng)分化能力很弱。綜合比較，誘導(dǎo)西番蓮子葉愈傷組織的最適培養(yǎng)基為：MS+2,4-D 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L。

表 3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on callus induction

2.2 生長素與分裂素不同配比對(duì)愈傷組織分化芽的影響

在誘導(dǎo)愈傷組織的過程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2,4-D的濃度在0.5 mg/L時(shí)分化出不定芽，所以在誘導(dǎo)愈傷組織分化芽時(shí)將2,4-D濃度設(shè)置在0.5 mg/L，將TDZ的濃度分別設(shè)置在0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。愈傷組織接進(jìn)培養(yǎng)基15 d左右開始有不定芽分化出來，40 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4。由表4可知，4個(gè)處理之間的分化率差異不顯著。當(dāng)TDZ濃度為2.0 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最高，為46.67%，且誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)量較多，芽較粗壯，適合做誘導(dǎo)繼代材料，誘導(dǎo)率最低的TDZ為1.5 mg/L，為6.67%，不定芽數(shù)量較少，但是分化出的不定芽較高，說明提高TDZ的濃度，可能對(duì)芽的分化以及生長是比較有利的。綜合來看，誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽的最適培養(yǎng)基為：MS+2,4-D 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L。

圖 1 西番蓮誘導(dǎo)分化Fig. 1 Induced differentiation of P. caerulea

表 4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織分化芽的影響Table 4 Effects of the different hormone combinations on callus differentiation buds

2.3 生長素與分裂素不同配比對(duì)不定芽增殖的影響

不同的細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)西番蓮不定芽增殖，前期實(shí)驗(yàn)表明以6-BA的增殖效果最好。將生長到基本一致的不定芽切下，接到不同濃度的6-BA與IAA組合的培養(yǎng)基上，各處理可對(duì)誘導(dǎo)出的不定芽進(jìn)行增殖，初期不定芽傷口處膨大長出少量黃綠色愈傷，培養(yǎng)10 d左右在芽的基部開始有少量不定芽點(diǎn)長出，增殖倍數(shù)從1.43～2.97（表5），平均的啟動(dòng)時(shí)間集中在10～15 d，45 d后統(tǒng)計(jì)芽的增殖數(shù)量。結(jié)果表明，不同處理對(duì)不定芽增殖率影響達(dá)到了顯著水平，用Duncan法對(duì)每個(gè)處理進(jìn)行多重比較，處理2的增殖率顯著高于除了處理5、7的其他處理。處理2的增殖倍數(shù)最高，為2.97，此時(shí)6-BA的濃度為1.0 mg/L，IAA的濃度為0.3 mg/L，苗的長勢(shì)較好，比較健壯，葉片展開面積較大，且為嫩綠色。增殖倍數(shù)最低的是處理8，為1.43，此時(shí)6-BA的濃度為3.0 mg/L，IAA的濃度為0.3 mg/L。由結(jié)果還可以看出，當(dāng)IAA濃度為0.3 mg/L時(shí)，隨著6-BA的濃度增大，增殖倍數(shù)呈下降趨勢(shì)，當(dāng)6-BA達(dá)到3.0 mg/L時(shí)，愈傷組織分化不定芽的時(shí)間最遲，增殖的不定芽植株較矮，在統(tǒng)計(jì)28 d左右逐漸出現(xiàn)基部葉片脫落死亡的現(xiàn)象，而且整個(gè)不定芽的葉片均偏黃綠色，不利于繼代使用，說明6-BA濃度過高可能會(huì)抑制芽的增殖。

進(jìn)一步進(jìn)行極差分析（表6），由表6可知，影響不定芽增殖的主導(dǎo)因子是生長素IAA，理論優(yōu)水平組合為處理2（A1B2），與實(shí)際結(jié)果相同，培養(yǎng)45 d后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，以MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L為最佳增殖培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)為2.97。隨著6-BA的濃度增大，增殖倍數(shù)卻在減小，對(duì)因素水平進(jìn)行方差分析，PA≈0.422＞0.05，表明6-BA濃度的變化對(duì)增殖倍數(shù)的影響差異不顯著。而隨著IAA濃度的增大，增殖倍數(shù)先增大后降低，PB≈0.065＞0.05，表明IAA濃度的變化對(duì)增殖倍數(shù)的影響差異不顯著?？紤]6-BA與IAA交互作用時(shí)，隨著2種植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的增大，增殖倍數(shù)先增大后降低，但是PA×B=0.084＞0.05，表明2種植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度變化對(duì)增殖倍數(shù)的影響差異不顯著。

表 5 不同處理組合芽的增殖效果統(tǒng)計(jì)學(xué)描述Table 5 Descriptive statistics of the proliferation effect of the different combinations of buds

表 6 因素水平的極差分析Table 6 Range analysis of factors and levels

3 結(jié)論與討論

在秋水仙素處理愈傷組織進(jìn)行加倍的過程中，愈傷組織的分化效率會(huì)直接影響倍性育種的進(jìn)程。而在建立穩(wěn)定高效的植株再生體系中，外植體選擇是至關(guān)重要的。本研究以子葉為愈傷組織誘導(dǎo)的初始材料，子葉薄壁組織含量高，是植株再生過程中較為理想的材料。與來自室外母株的成熟莖段上的葉片相比，生理狀態(tài)處于幼嫩時(shí)期，愈傷組織誘導(dǎo)率較高，且誘導(dǎo)時(shí)間較短，再生能力較強(qiáng)[12]。西番蓮種子的外種皮十分堅(jiān)硬、且種子小，直接挑取子葉十分困難。而經(jīng)濃硫酸浸泡種皮炭化一部分去種皮再萌發(fā)，取無菌苗的子葉作為外植體，可以極大避免污染的發(fā)生[10]。

植物生長調(diào)節(jié)劑能夠有效促進(jìn)愈傷組織的形成、側(cè)芽的萌發(fā)和不定芽的產(chǎn)生。TDZ作為一種高效的分裂素，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)有效的刺激植株再生[13]。2,4-D是一種人工合成的植物生長素，在低濃度時(shí)刺激植物生長，并促進(jìn)愈傷組織的形成，但在高濃度時(shí)，則會(huì)抑制生長甚至毒殺植物[14]。愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果表明，高濃度的2,4-D和TDZ雖然能刺激植株的愈傷組織生長，但是生長出來的愈傷組織很難繼續(xù)分化，不利于芽的誘導(dǎo)以及愈傷組織增殖培養(yǎng)。愈傷組織的誘導(dǎo)受外植體的類型影響較大，而選用合適的外植體，能大大提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。史沉魚等[10]利用種子萌發(fā)的無菌材料根部誘導(dǎo)愈傷組織最優(yōu)處理MS+2,4-D 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，誘導(dǎo)率最高僅為32%。包英華等[15]對(duì)豇豆（Vigna unguiculata）豐產(chǎn)2號(hào)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)愈傷誘導(dǎo)率下胚軸＞頂芽＞上胚軸＞真葉。而在之后陳高等[16]研究豇豆的子葉和下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，證明愈傷組織誘導(dǎo)率子葉＞下胚軸。但是愈傷組織的分化，較愈傷組織的誘導(dǎo)，其難度更高。在研究結(jié)果可以看出，經(jīng)愈傷組織再分化，不定芽的誘導(dǎo)率明顯要低于愈傷組織的誘導(dǎo)率。李紅艷等[17]在研究西番蓮離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)由不同部位誘導(dǎo)出來的愈傷組織進(jìn)行芽的分化，莖段愈傷組織的不定芽誘導(dǎo)率最高為12.5%，葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織，不定芽誘導(dǎo)率為1.39%，而由葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織則未能分化。而此次實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)子葉誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行芽的分化，分化率最高為46.67%，最適培養(yǎng)基為：MS+2,4-D 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L，明顯高于前人所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

繁殖體的增殖，植物生長調(diào)節(jié)劑是一個(gè)非常關(guān)鍵的要素。不定芽增殖過程中，隨著6-BA濃度的升高，不定芽增殖倍數(shù)整體呈下降趨勢(shì)，雖然處理7在6-BA為3.0 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)達(dá)到2.17，但經(jīng)多次繼代后，會(huì)形成較多的畸形芽，導(dǎo)致有效芽的數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；而低濃度的6-BA誘導(dǎo)出的苗會(huì)保持較高活力，且畸形苗少。這表明較高濃度的分裂素，雖然可以促進(jìn)不定芽再生，但不利于繼代增殖。張琴等[4]曾利用子葉誘導(dǎo)出的不定芽進(jìn)行增殖，增殖系數(shù)最高為3.0，最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。陳發(fā)興[18]利用西番蓮的莖段誘導(dǎo)出的不定芽進(jìn)行增殖，增殖系數(shù)最高為3.3，最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。本次實(shí)驗(yàn)的增殖倍數(shù)最高為2.97，最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L，結(jié)果低于二人所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明不同外植體材料對(duì)分化出的不定芽增殖有非常重要的影響[19]。不同種類及配比的生長素與分裂素對(duì)不定芽的分化也起到了至關(guān)重要的作用[20-22]，分裂素與生長素的配比大時(shí)分化率較高，但是過高則會(huì)抑制芽的形成，而且對(duì)繼代增殖也有不利的影響，這與本次研究結(jié)果是相似。

本實(shí)驗(yàn)以紫果西番蓮無菌苗的子葉為外植體開展了植株再生體系的研究，其中愈傷組織誘導(dǎo)率為73.33%，愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)率為46.67%，不定芽的繼代增殖倍數(shù)為2.97。建立的紫果西番蓮植株再生體系，可滿足后期的多倍體育種需求，也可為工廠化育苗、遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)參考。