基于Tet-On系統(tǒng)構(gòu)建Alb啟動子調(diào)控豬uPA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的慢病毒載體

劉 宇，陳恒偉，溫悅婷，賈俊雙，林曉琳，肖 東, *

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動物中心，廣州 510515； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣州 510515)

肝臟疾病(如病毒性肝炎、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和肝癌等)是威脅人類健康的最嚴(yán)重的疾病之一[1]。理想動物模型的缺乏在很大程度上制約了肝臟相關(guān)疾病研究和新藥篩選等，而肝人源化的小鼠模型或人-鼠嵌合肝小鼠模型在各種肝臟相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選等方面已展示出中巨大的應(yīng)用價(jià)值[1-3]。但是與小型實(shí)驗(yàn)動物(如小鼠)相比，大型實(shí)驗(yàn)動物(如小型豬)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢。首先，其在解剖、生理、生化代謝和疾病發(fā)生等方面與人類相似，體型適中，器官尺度與人的接近，有利于手術(shù)操作；再者壽命達(dá) 10 年以上，便于研究的長期追蹤[4]。創(chuàng)制肝人源化豬模型的先決條件之一是擁有肝損傷的豬模型。已有研究表明，在Alb-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠肝中特異過表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase plasminogen activator, uPA)轉(zhuǎn)基因，可使小鼠發(fā)生肝損傷；移植小鼠原代肝細(xì)胞可有效在受損的Alb-uPA小鼠肝上重建小鼠的肝[5-7]。亦有研究者應(yīng)用SCID/Alb-uPA免疫缺陷和肝損傷的小鼠模型移植人肝細(xì)胞，成功在受損的鼠肝上重建了人的肝，嵌合肝中人肝細(xì)胞嵌合率高達(dá)80%～90%，甚至接近100%[8-10]。Alb-uPA小鼠作為肝損傷模型具有以下不足：新生小鼠死亡率高，繁殖困難；肝細(xì)胞移植手術(shù)的窗口期短，需要在小鼠出生后二周內(nèi)進(jìn)行，移植技術(shù)難度大，死亡率高等缺點(diǎn)[1-3]。四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(包括Tet-on系統(tǒng)和Tet-off系統(tǒng))是迄今為止在體內(nèi)和體外應(yīng)用最為成功和最為廣泛的調(diào)控系統(tǒng)之一[11-12]。有鑒于此，我們擬結(jié)合Tet-on基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)和Alb啟動子，建立可誘導(dǎo)和肝特異過表達(dá)豬uPA的轉(zhuǎn)基因小型豬，以最終創(chuàng)制藥物(強(qiáng)力霉素，Dox)可調(diào)控的高效肝損傷豬模型；該模型借助Tet-on系統(tǒng)，可通過Dox誘導(dǎo)uPA于肝特異激活，引起豬的肝損傷。該藥物可調(diào)控的肝損傷豬模型與免疫缺陷豬交配，獲得免疫缺陷的誘導(dǎo)型肝損傷模型，該模型通過移植人肝細(xì)胞，可獲得真正意義上的肝人源化的豬模型。目前，慢病毒載體法已成功用于制備轉(zhuǎn)基因豬和轉(zhuǎn)基因猴[13]。本文主要研究目的在于基于Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建白蛋白(albumin, Alb)啟動子調(diào)控豬uPA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的慢病毒載體，并對載體的功能和Tet-on系統(tǒng)工作的有效性進(jìn)行驗(yàn)證，為借助慢病毒載體法制備uPA轉(zhuǎn)基因豬，并進(jìn)而創(chuàng)制藥物可調(diào)控的肝損傷豬模型奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 載體

攜帶肝特異性Alb啟動子的質(zhì)粒載體pAlb-Cre-GH/BS受贈于美國Mark A. Magnuson教授[14]，攜帶puPA基因片段的H8803質(zhì)粒以基因合成方式購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司，攜帶all-in-one Tet-On?3G系統(tǒng)的pLVX-TetOne購自TaKaRa公司，攜帶T2A-CopGFP基因片段的慢病毒載體pCD823A-1購自System Biosciences (SBI)公司。

1.1.2 細(xì)胞

293T細(xì)胞來源和培養(yǎng)方法等參見文獻(xiàn)[15]。

1.2 主要試劑與儀器

2× rTag Master Mix購自廣州艾基生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶和In-Fusion克隆試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine3000、高糖DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM I Medium和DMSO等購自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司；其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)純或分析純。Bio-Rad S1000TMThermal Cycler PCR儀和Bio-Rad Molecular Imager ChemiDocTMXRS+ System化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；Nikon ECLIPSE TI-U倒置顯微鏡購自尼康儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基于Tet-On 3G系統(tǒng)構(gòu)建Alb啟動子調(diào)控小型豬uPA轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞特異性表達(dá)的慢病毒載體pLATTPUTG

分三步構(gòu)建慢病毒載體pLATTPUTG。第一步，將質(zhì)粒pAlb-Cre-GH/BS作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增Alb-enhancer/promoter啟動子片段2346 bp，In-Fusion克隆至利用XhoI/XbaI雙酶切的pLVX-TetOne質(zhì)粒中，以最終獲得Alb啟動子替換pLVX-TetOne原有的PGK啟動子的質(zhì)粒pLVX-Alb-TetOne；第二步，以pCD823 A-1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增T2A-CopGFP序列片段 (863 bp)，In-Fusion克隆至利用BamH I/AgeI雙酶切的pLVX-Alb-TetOne質(zhì)粒中，獲得pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG)質(zhì)粒；第三步，以H8803質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增1350 bp豬的uPA(puPA)片段(3′端含F(xiàn)lag標(biāo)簽)，In-Fusion克隆至pLATTTG質(zhì)粒中，最終獲得慢病毒載體pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG)。以上載體pLVX-Alb-TetOne、pLATTTG和pLATTPUTG均經(jīng)測序和酶切鑒定。

1.3.2 pLATTPUTG體外功能驗(yàn)證

借助 LipofectamineTM3000在六孔板內(nèi)將質(zhì)粒pLATTPUTG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，總共轉(zhuǎn)染6個(gè)孔。24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察各孔細(xì)胞發(fā)熒光情況，并拍照；拍照后，選取其中3孔加入強(qiáng)力霉素(Doxycycline，Dox)(濃度為50 ng/mL)，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察各孔細(xì)胞發(fā)熒光情況(含未加Dox的孔)，并拍照；隨后收集細(xì)胞以提取總RNA和總蛋白?？俁NA提取后，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再利用qRT-PCR檢測puPA和CopGFP在mRNA水平的表達(dá)； qRT-PCR用引物：puPA-FP，GTCACCGGCCTGC TTATGAT，puPA-RP，CAAGGCTGGTTCTCGATGGT；CopGFP-FP，CTACCACTTCGGCACCTACC，CopGFP-RP，GTACTTCTCGATGCGGGTGT，GAPDH-FP，ACC CAGAAGACTGTGGATGG，GAPDH-RP，TCTAGACG GCAGGTCAGGTC。提取總蛋白，Western blot檢測Flag標(biāo)簽蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體pLATTPUTG構(gòu)建和鑒定

pLATTPUTG構(gòu)建分三步完成， pLATTPUTG的載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖1A所示。

2.1.1 構(gòu)建載體pLVX-Alb-TetOne

以質(zhì)粒pAlb-Cre-GH/BS作為模板，PCR擴(kuò)增Alb-enhancer/promoter啟動子片段，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，條帶與理論預(yù)測值2346 bp相符(結(jié)果未顯示)。將此Insert DNA產(chǎn)物In-Fusion克隆至利用XhoI/XbaI雙酶切的pLVX-TetOne質(zhì)粒中，獲得擬構(gòu)建的載體pLVX-Alb-TetOne。對質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果與預(yù)期相符(結(jié)果未顯示)。

2.1.2 構(gòu)建載體pLATTTG

以pCD823A-1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增T2A-CopGFP片段，取1 μL產(chǎn)物電泳可見一條帶，與理論預(yù)測值863 bp相符(圖1B；Lane 2：Insert DNA)。將此片段In-Fusion克隆至利用BamH I/AgeI雙酶切的pLVX-Alb-TetOne質(zhì)粒(圖1B；Lane 1：Vector DNA)中，獲得所需構(gòu)建的載體pLATTTG。pLATTTG經(jīng)BamH I酶切并電泳可見一條帶，其長度與理論預(yù)測值相符(圖1B)；pLATTTG經(jīng)BamH I和KpnI酶切產(chǎn)生兩條片段，其大小與理論預(yù)測值相符(圖1B)；pLATTTG經(jīng)SalI酶切產(chǎn)生的兩條帶，亦與理論預(yù)測值一致(圖1B)。同時(shí)，對pLATTTG質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果與預(yù)期相符(結(jié)果未顯示)。

2.1.3 載體pLATTPUTG構(gòu)建

注：A：pLATTPUTG載體示意圖。LTR：長末端重復(fù)序列；WPRE：土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件；Alb promoter：白蛋白啟動子；TRE3GS promoter：TRE3GS啟動子；puPA/pPLAU：豬尿激酶型纖溶酶原激活劑；T2A：從Thosea asigna病毒中得到的2 A短肽；CopGFP：橈足類綠色熒光蛋白。B：pLATTTG載體酶切鑒定結(jié)果。泳道M1：λ-Hind III digest(TAKARA)；泳道1：Vector DNA；泳道2：Insert DNA；泳道3：pLATTTG-BamH I；泳道4：pLATTTG-BamH I/Kpn I；泳道5：pLATTTG-Sal I；泳道M2：DL2000 DNA marker。C：pLATTPUTG載體酶切鑒定結(jié)果。泳道M1：λ-Hind III digest(TAKARA)；泳道1：Vector DNA；泳道2：Insert DNA；泳道3：pLATTPUTG-Kpn I；泳道4：pLATTPUTG-Xho I/Kpn I；泳道5：pLATTPUTG-Sal I；泳道M2：DL2000 DNA marker。圖1 pLATTPUTG結(jié)構(gòu)示意圖及載體酶切鑒定Note. A, Schematic illustration of pLATTPUTG. LTR: long terminal repeat; WPRE: woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element; Alb promoter: albumin promoter; TRE3GS promoter: TRE3GS promoter; puPA/pPLAU: rat urokinase-type plasminogen activator; T2A: the 2 A peptides from Thosea asigna virus (T2A); CopGFP: copepod Pontellina plumata green fluorescence protein. B, Enzyme digestion identification of pLATTTG. Lane M1: λ-HindIII digest (TAKARA); Lane 1: Vector DNA; Lane 2: Insert DNA; Lane 3: pLATTTG-BamHI; Lane 4: pLATTTG-BamHI/KpnI; Lane 5: pLATTTG-SalI; Lane M2: DL2000 DNA marker. C, Enzyme digestion identification of pLATTPUTG. Lane M1: λ-HindIII digest (TAKARA); Lane 1: Vector DNA; Lane 2: Insert DNA; Lane 3: pLATTPUTG-KpnI; Lane 4: pLATTPUTG-XhoI/KpnI; Lane 5: pLATTPUTG-SalI; Lane M2: DL2000 DNA marker.Figure 1 Schematic illustration of pLATTPUTG and the resulting plasmids identified by enzyme digestion

以質(zhì)粒H8803為模板，PCR擴(kuò)增puPA+Flag基因片段，In-Fusion克隆至利用AgeI/BamH I酶切的pLATTTG質(zhì)粒中，得到的最終載體命名為pLATTPUTG。次日挑選單菌落，提取質(zhì)粒并行測序和酶切鑒定。pLATTPUTG酶切鑒定結(jié)果如圖1C示：PCR擴(kuò)增的puPA+Flag基因片段電泳可見一條帶，與理論預(yù)測值1350 bp相符(圖1C；Lane 2：Insert DNA)；經(jīng)AgeI/BamH I雙酶切后線性化的pLATTTG電泳可見一條帶，與理論預(yù)測值10965 bp相符(圖1C；Lane 1：Vector DNA)；pLATTPUTG經(jīng)KpnI酶切電泳可見一條帶，其長度與理論預(yù)測值相符(圖1C)；pLATTPUTG經(jīng)XhoI/KpnI雙酶切產(chǎn)生兩條片段，其大小與理論預(yù)測值3868 bp和8418 bp相符(圖1C)；pLATTPUTG經(jīng)SalI酶切則可產(chǎn)生兩條帶，與理論預(yù)測值2185 bp和10101 bp一致(圖1C)。同時(shí)，對質(zhì)粒pLATTPUTG進(jìn)行測序，結(jié)果與預(yù)期相符(結(jié)果未顯示)。以上結(jié)果表明慢病毒載體pLATTPUTG構(gòu)建成功。

2.2 pLATTPUTG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

攜帶puPA和CopGFP基因的載體pLATTPUTG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后倒置熒光顯微鏡下未見細(xì)胞發(fā)綠色熒光(圖2A)。六孔板內(nèi)加入誘導(dǎo)劑Dox后48 h，加Dox的孔內(nèi)幾乎所有細(xì)胞發(fā)強(qiáng)的綠色熒光，而不加Dox的孔內(nèi)仍然未見綠色熒光(圖 2B)。以上數(shù)據(jù)預(yù)示，應(yīng)用該Tet-On基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了報(bào)告基因CopGFP在293T細(xì)胞上的可誘導(dǎo)性表達(dá)。

注：A：倒置熒光顯微鏡檢測瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG 24 h，不加Dox的293T細(xì)胞上報(bào)告基因CopGFP表達(dá)。B：倒置熒光顯微鏡檢測瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG 72 h，加入Dox的293T細(xì)胞上報(bào)告基因CopGFP表達(dá)。圖2 倒置熒光顯微鏡檢測瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG的293T細(xì)胞上報(bào)告基因CopGFP表達(dá)(不加或加Dox)(× 100)Note. A, CopGFP assay in 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG for 24 h in the absence of Dox. B, CopGFP assay in 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG for 72 h in the presence of Dox for 48 h.Figure 2 CopGFP assay under an inverted fluorescence microscope in 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG in the absence or presence of Dox

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pLATTPUTG的細(xì)胞中puPA、CopGFP和標(biāo)簽蛋白Flag表達(dá)

首先，利用qRT-PCR檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pLATTPUTG的293T細(xì)胞中puPA和CopGFP的表達(dá)水平；結(jié)果顯示，與不加Dox的孔內(nèi)細(xì)胞相比，加Dox的孔內(nèi)細(xì)胞上puPA和CopGFP表達(dá)水平明顯升高(圖3A)。Western blot檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pLATTPUTG的293T細(xì)胞中Flag表達(dá)；結(jié)果顯示，不加Dox的孔內(nèi)細(xì)胞上僅能檢測到極弱的條帶，而加Dox的孔內(nèi)細(xì)胞上則檢測到Flag極強(qiáng)的表達(dá)(圖3B)。

注：A：熒光定量PCR檢測瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG 48 h，加入和不加入Dox的293T細(xì)胞上puPA和CopGFP的表達(dá)。與不加Dox比較，###P<0.001，**P<0.01。B：免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG 48 h，加入和不加入Dox的293T細(xì)胞上標(biāo)簽蛋白的表達(dá)。泳道1∶293T細(xì)胞；泳道2∶293T細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG (-Dox)；泳道3∶293T細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG (+Dox)。圖3 瞬轉(zhuǎn)pLATTPUTG的293T細(xì)胞中CopGFP、puPA和Flag表達(dá)水平 (加Dox)Note. A, In the presence of Dox, qRT-PCR was used to test the expressions of puPA and CopGFP in 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG for 48 h. Compared with those without Dox,### P<0.001,**P<0.01. B, In the presence of Dox, western blot was used to determine the expression of Flag transgenes in 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG for 48 h. Lane 1: 293T cells; Lane 2: 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG (-Dox); Lane 3: 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG (+Dox).Figure 3 The expressions of CopGFP, puPA, and Flag transgenes in 293T cells transiently transfected with pLATTPUTG in the presence of Dox

3 討論

本研究基于Tet-On系統(tǒng)成功構(gòu)建了Alb啟動子調(diào)控豬uPA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的慢病毒載體pLATTPUTG。我們的體外數(shù)據(jù)表明，該Tet-On基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了puPA、CopGFP和Flag基因在293T細(xì)胞上可誘導(dǎo)性表達(dá)，這些為建立LATTPUTG轉(zhuǎn)基因豬打下了良好基礎(chǔ)。

如圖1A所示，我們聯(lián)合采用該Tet-On基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)和肝細(xì)胞特異性啟動子Alb，以實(shí)現(xiàn)puPA轉(zhuǎn)基因特異性在豬肝細(xì)胞上可誘導(dǎo)性表達(dá)，為最終建立藥物可控的肝損傷豬模型奠定基礎(chǔ)。目前現(xiàn)有的Fah-/-肝損傷豬模型[延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)ah)基因敲除豬][16-19]，有其缺陷性；與其相比，我們基于Tet-On系統(tǒng)利用Dox誘導(dǎo)的肝損傷模型具有更多優(yōu)勢，首先，F(xiàn)ah-/-豬的肝損傷是不可逆的，且嚴(yán)重依賴于保肝藥物NTBC(2-(2-硝基-4-三氟甲基芐基) -環(huán)己烷-1，3-二酮)，需要持續(xù)服用來維持生命；當(dāng)在飲食中停止加入NTBC，豬就會在7周左右死亡。另外，NTBC價(jià)格昂貴，使用基于Fah-/-豬建立的肝損傷動物模型將會產(chǎn)生高昂成本。而建立LATTPUTG轉(zhuǎn)基因豬后，只需腹腔注射Dox，便可誘導(dǎo)肝損傷，操作簡便且建立模型時(shí)間較為靈活，同時(shí)成本低。此外，載體pLATTPUTG引進(jìn)了報(bào)告基因CopGFP，copGFP有利于慢病毒生產(chǎn)和病毒滴度測定。