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    逍遙散對(duì)脂多糖誘導(dǎo)抑郁樣行為的影響

    2019-06-01 02:50:46石博宇葉曉林劉小波
    中成藥 2019年4期
    關(guān)鍵詞:含藥海馬批號(hào)

    石博宇, 葉曉林, 羅 杰, 劉小波, 彭 希, 劉 蓉, 曾 南

    (成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 四川 成都 611137)

    抑郁癥是一種臨床常見的精神障礙性疾病, 以持續(xù)性情緒淡漠、 悲觀等為主要臨床特征, 大量研究表明炎癥反應(yīng)與其病理生理機(jī)制密切相關(guān)。 逍遙散始載于宋代《太平惠民和劑局方》, 是中醫(yī)調(diào)治情志活動(dòng)異常的經(jīng)典名方, 具有疏肝解郁、 養(yǎng)血健脾之功效, 主治肝郁血虛脾弱諸證; 現(xiàn)代藥理研究顯示, 它具有抗抑郁、 調(diào)節(jié)中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平、 調(diào)控體內(nèi)激素水平、 調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。 本實(shí)驗(yàn)基于炎癥可誘發(fā)抑郁癥的認(rèn)識(shí)及逍遙散具有一定抗炎作用的基礎(chǔ), 在體內(nèi)、 體外實(shí)驗(yàn)采用脂多糖誘導(dǎo)抑郁樣行為, 觀察逍遙散對(duì)其影響, 以期為相關(guān)臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠, 雄性, 體質(zhì)量18~22 g; SPF 級(jí)新生24 h SD 乳鼠; SPF 級(jí)SD 大鼠, 雄性, 體質(zhì)量180~220 g, 均由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供, 合格證號(hào) SCXK (川)2013-24。

    1.2 藥物 逍遙散藥材飲片(柴胡、 當(dāng)歸、 白芍、 白術(shù)、 茯苓、 薄荷、 生姜、 甘草) 購自成都太極大藥房。 水煎液制備方法為按方劑組成要求[1]取相應(yīng)量藥材, 8 倍量水浸泡30 min, 加熱煮沸后文火煎煮60 min, 趁熱過濾藥液, 再加6 倍量水同法分別煎煮40、 30 min, 合并3 次濾液,60 ℃下減壓濃縮至所需濃度(1.5 g 生藥/mL),生藥量分別為30、 15 g/kg, 相當(dāng)于成人臨床日用量的30、 15 倍。 含藥血清制備方法為將大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組和逍遙散高劑量組(30 g/kg), 連續(xù)灌胃給藥7 d, 每天1 次, 末次給藥1 h后麻醉大鼠, 腹主動(dòng)脈取血, 3 500 r/min 離心10 min, 分 離 血 清, 每 組 混 合, 56 ℃水 浴30 min滅活, 0.22 μm 微孔濾膜過濾分裝, -20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 試劑 鹽酸氟西汀膠囊(法國Patheon 公司,20 mg, 國藥準(zhǔn)字J20130010, 批號(hào)6607A); 鹽酸氟 西 汀 (批 號(hào) SLBM4298V)、 脂 多 糖 (批 號(hào)086M4159V)、 DAPI (批號(hào)066M4053V) (美國Sigma 公 司); Hanks 液 (批 號(hào)1752164)、 B-27(批號(hào)1813319)、 L-谷氨酰胺 (批號(hào)1816803)、Neurobasal-A 培養(yǎng)基(批號(hào)1852901) (美國Gibco公司); 胎牛血清(呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司, 批號(hào)150501); DMEM 培養(yǎng)基(美國HyClone 公司, 批號(hào)AB10134657); 小鼠IL-6、TNF-α, 大鼠TNF-α ELISA 試劑盒(欣博盛生物科技有限公司, 批號(hào)M170221-004a、 M170221-102a、R170110-102a); 小鼠IL-6、 TNF-α, 大鼠TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司, 批 號(hào)21G137、 21G152、 21G128、 21G156);小鼠IDO、 5-HT, 大鼠5-HT、 IDO ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所, 批號(hào)01/2018、 01/2018、 02/2018、 02/2018); NO 檢測(cè)試劑盒 (批號(hào)081216161111)、 乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)112316170306) (上海碧云天生物技術(shù)有限公司); 兔源NeuN 單克隆抗體(美國Cell signaling Technology 公司, 貨號(hào)5292S、 24307S); 山羊抗兔IgG/Cy3 [愛必信(上海) 生物科技有限公司, 批 號(hào)10、 AG04017512]; FastQuant RT Kit(Witn gDNase) 100rxn (批號(hào)Q5725)、 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 20 μL×500rxn (批號(hào)Q5516) [天根生化科技(北京) 有限公司]。

    1.4 儀器 3001 型酶標(biāo)儀、 3111 二氧化碳培養(yǎng)箱、 ST16R 冷凍離心機(jī)、 NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì) (美國Thermo Fisher Scientific 公司);TS-200 小鼠懸尾測(cè)試儀 (成都泰盟科技有限公司); FV1200 激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公 司); iCycler iOMulticolor Real-Time PCR Dectection System (美國Bio-Rad 公司)。

    2 方法

    2.1 逍遙散對(duì)脂多糖致炎性抑郁樣小鼠的影響 取C57BL/6 J 小鼠, 適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組、 模型組、 氟西汀組(3.03 mg/kg) 及 逍 遙 散 低、 高 劑 量 組 (15、30 g/kg), 以0.02 mL/g 劑量連續(xù)灌胃給藥12 d,每天1 次, 空白組、 模型組給予等體積蒸餾水, 第11 天除空白組外, 其余各組小鼠腹腔注射脂多糖(1 mg/kg) 造模, 共2 次, 每次間隔30 min, 空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水[2]。 造模后, 所有小鼠于24 h 內(nèi)完成行為學(xué)測(cè)試, 分批進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn), 完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后小鼠取血分離血清, ELISA 法檢測(cè)血清IL-6、 TNF-α 水平, 再剖取大腦皮層和海馬組織, 4%多聚甲醛固定后制切片, 尼氏染色法觀察海馬神經(jīng)元尼氏小體數(shù),Image-Pro plus 圖像分析軟件測(cè)定海馬CA3 區(qū)尼氏小體(×400) 表達(dá)平均光密度; 另取1 批大腦皮層和海馬組織, PBS 緩沖液制備0.1 g/mL 組織勻漿, 離心, 收集上清液, ELISA 法檢測(cè)IL-6、 TNFα、 5-HT、 IDO 水平。

    2.2 逍遙散含藥血清對(duì)脂多糖致海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥模型的影響

    2.2.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞鑒定 將新生24 h 的SD乳鼠頸椎脫臼處死, 75%酒精消毒后置于盛有PBS液的平皿內(nèi), 剪開頭部皮膚, 迅速剝離海馬并置于冰冷PBS 液中, 移至盛有少量Hanks 液的小瓶中,眼科剪將組織剪成糜狀, 加入0.25% 胰蛋白酶,37 ℃下消化25 min, 棄上清后用PBS 洗2 次, 每次5 min, 棄上清, 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化, 反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液, 過150 目網(wǎng)篩, 收集細(xì)胞濾液, 離心(1 100 r/min、 4 ℃)5 min, 棄上清液, 加入適量含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。 然后, 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞, 調(diào)節(jié)細(xì)胞密度5×105/mL, 接種神經(jīng)細(xì)胞懸液于預(yù)先用poly-L-lysine 包被的48 孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔350 μL, 37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 全量更換為含2% B-27、 1% L-谷氨酰胺的Neurobasal-A 培養(yǎng)液, 以后每3 d 半量換液。 再觀察海馬神經(jīng)元生長形態(tài)[3], 并將培養(yǎng)12 d 的海馬神經(jīng)細(xì)胞用NeuN (1 ∶50 稀釋) 一抗和Cy3 (1 ∶100 稀釋) 二抗孵育, 1 μg/mL DAPI 染核, 激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定神經(jīng)元。

    2.2.2 含藥血清對(duì)脂多糖致海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型炎癥和色氨酸代謝通路的影響 按“2.2.1”項(xiàng)下方法體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞, 細(xì)胞在第7~10 天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期, 將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、 模型組、 氟西汀組 (10 μmol/L) 及空白血清、 含藥血清低、 高劑量組(4%、 8%), 培養(yǎng)至第10 天, 將含5 μg/mL 脂多糖的培養(yǎng)基加入除空白組以外的各組培養(yǎng)孔中造模, 空白組加入不含B-27 的Neurobasal-A 培養(yǎng)基, 每孔350 μL。 24 h后, 各組細(xì)胞給予含氟西汀(10 μmol/L)、 空白血清 (4%、 8%)、 含藥血清 (4%、 8%), 不含B-27 的Neurobasal-A 培養(yǎng)液, 空白組、 模型組均加入不含B-27 的Neurobasal-A 培養(yǎng)液, 每孔350 μL, 培養(yǎng)至第13 天, 收集上清, 檢測(cè)NO、IL-6、 TNF-α 水平; 收集裂解液, ELISA 法檢測(cè)5-HT、 IDO 水平; 提取各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定IL-6、 TNF-α、 5-HT1A、IDO1 mRNA 表達(dá), 所有引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司設(shè)計(jì)合成, 引物序列見表1。

    表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

    2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以s) 表示, 符合正態(tài)分布者, 采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn); 不符合者, 采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 逍遙散對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響 表2 顯示, 與空白組比較, 模型組小鼠2 個(gè)實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著延長(P<0.05, P<0.01); 與模型組比較, 逍遙散高劑量組2 個(gè)實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著縮短 (P <0.01), 低劑量組強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著縮短(P<0.01)。

    表2 逍遙散對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響s, n=6~7)Tab.2 Effect of Xiaoyao Powder on immobility time s, n=6-7)

    表2 逍遙散對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響s, n=6~7)Tab.2 Effect of Xiaoyao Powder on immobility time s, n=6-7)

    注:與空白組比較,#P <0.05,##P <0.01;與模型組比較,?P <0.05,??P<0.01

    空白組 — 178.24±6.82 121.55±13.92模型組 — 213.13±8.51## 141.97±12.17#氟西汀組 3.03 mg/kg 124.80±46.58?? 124.07±9.33?逍遙散組 15 196.69±19.29 98.48±17.27??逍遙散組 30 171.15±4.16?? 74.18±19.44??

    3.2 逍遙散對(duì)IL-6、 TNF-α 水平的影響 表3 顯示, 與空白組比較, 模型組血清、 皮層IL-6、 TNF-α 水平及海馬IL-6 水平顯著升高(P <0.05, P <0.01); 與模型組比較, 逍遙散組血清IL-6 水平顯著降低(P<0.05), 皮層TNF-α、 IL-6 水平顯著下調(diào)(P<0.05, P<0.01), 并且低劑量組海馬IL-6水平顯著降低(P<0.05)。

    3.3 逍遙散對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響 表4 顯示, 與空白組比較, 模型組海馬、 皮層5-HT 水平顯著降低(P<0.05, P<0.01), 皮層IDO 水平顯著升高(P<0.05); 與模型組比較, 逍遙散組海馬5-HT 水平顯著上調(diào), 皮層IDO 水平顯著下調(diào)(P<0.05, P<0.01), 并且高劑量組皮層5-HT 水平顯著上調(diào)(P<0.01)。

    表3 逍遙散對(duì)IL-6、 TNF-α 水平的影響 n=4~6)Tab.3 Effects of Xiaoyao Powder on IL-6 and TNF-α levels n=4-6)

    表3 逍遙散對(duì)IL-6、 TNF-α 水平的影響 n=4~6)Tab.3 Effects of Xiaoyao Powder on IL-6 and TNF-α levels n=4-6)

    注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,?P<0.05,??P<0.01

    組別 劑量/(g·kg-1)皮層IL-6/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1) IL-6/(ng·g-1) TNF-α/(ng·g-1) IL-6/(ng·g-1) TNF-α/(ng·g-1)血清海馬空白組 — 38.73±10.10 81.31±2.13 0.79±0.10 1.07±0.16 0.57±0.07 0.64±0.18模型組 — 82.23±29.99# 91.84±9.60# 1.00±0.16# 1.14±0.22 1.11±0.19## 1.12±0.15#氟西汀組3.03 mg/kg 39.65±1.95? 84.16±2.30 0.80±0.27 1.02±0.15 0.78±0.09?? 0.74±0.09?逍遙散組 15 48.54±14.14? 88.48±5.30 0.74±0.17? 0.99±0.18 0.65±0.13?? 0.62±0.07?逍遙散組 30 48.41±14.22? 90.15±0.22 0.75±0.34 1.32±0.39 0.59±0.21?? 0.64±0.02?

    表4 逍遙散對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響, n=5)Tab.4 Effects of Xiaoyao Powder on 5-HT and IDO levels , n=5)

    表4 逍遙散對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響, n=5)Tab.4 Effects of Xiaoyao Powder on 5-HT and IDO levels , n=5)

    注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,?P<0.05,??P<0.01

    空白組 — 708.46±218.79 85.15±20.93 627.02±53.56 63.46±41.28模型組 — 412.67±98.44# 142.52±58.81 353.97±32.86## 127.06±30.13#氟西汀組 3.03 mg/kg 688.66±56.07?? 120.58±42.74 616.72±135.61?? 57.93±35.28?逍遙散組 15 671.32±69.07?? 138.55±54.53 366.62±23.98 86.51±17.25?逍遙散組 30 742.88±105.51?? 126.23±56.25 653.29±132.60?? 65.57±43.17?

    3.4 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響 表5、 圖1 顯示,與空白組比較, 模型組小鼠海馬神經(jīng)元損傷, 排列不規(guī)則, 分層不清楚, 尼氏小體數(shù)減少, 呈較明顯空泡狀, 平均光密度顯著降低(P<0.01); 與模型組比較, 逍遙散高劑量組平均光密度顯著增加(P<0.05)。

    表5 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響±s, n=6)Tab.5 Effect of Xiaoyao Powder on Nissl bodies n=6)

    表5 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響±s, n=6)Tab.5 Effect of Xiaoyao Powder on Nissl bodies n=6)

    注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,?P<0.05,??P<0.01

    組別 劑量/(g·kg-1) 平均光密度空白組 — 48.14±5.03模型組 — 28.69±3.40##氟西汀組 3.03 mg/kg 39.37±4.96??逍遙散組 15 31.48±2.34逍遙散組 30 33.03±7.90?

    3.5 大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞體外生長形態(tài)觀察及鑒定 海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種24 h 后, 其中有很多神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞, 其胞體較小, 數(shù)量較少, 再進(jìn)行全量更換為Neurobasal-A 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后, 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少, 海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多,而且胞體飽滿。 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長, 神經(jīng)元細(xì)胞純度更高, 長出神經(jīng)突觸, 并呈現(xiàn)聚團(tuán)生長, 胞體飽滿, 有光澤, 細(xì)胞生長到第10 天時(shí)細(xì)胞聚集成團(tuán),神經(jīng)突觸明顯增長。

    NeuN 是神經(jīng)元特異標(biāo)記物, 神經(jīng)元細(xì)胞可被NeuN-Cy3 標(biāo)記為紅色。 圖2 顯示, 經(jīng)NeuN、 DAPI雙染色后, 培養(yǎng)12 d 的細(xì)胞紅色、 藍(lán)色熒光分布基本重合, 表明所培養(yǎng)細(xì)胞為成熟神經(jīng)元細(xì)胞, 純度可達(dá)95%以上。

    圖1 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響(×400)Fig.1 Effect of Xiaoyao Powder on Nissl bodies (×400)

    3.6 含藥血清對(duì)NO、 IL-6、 TNF-α水平的影響 表6 顯示, 與空白組比較, 模型組NO、 IL-6、 TNF-α 水平顯著升高 (P <0.01); 與模型組比較, 含藥血清高劑量組三者水平顯著下調(diào)(P<0.01)。

    圖2 大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞鑒定Fig.2 Identification of primary hippocampalneuron cells in rats

    表6 含藥血清對(duì)NO、 IL-6、 TNF-α 水平的影響=4~6)Tab.6 Effects of medicated serum on NO, IL-6 and TNF-α levels=4-6)

    表6 含藥血清對(duì)NO、 IL-6、 TNF-α 水平的影響=4~6)Tab.6 Effects of medicated serum on NO, IL-6 and TNF-α levels=4-6)

    注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,??P<0.01;與空白血清高劑量組比較,△P<0.05

    空白組 — 1.27±0.08 223.45±19.71 18.86±1.70模型組 — 13.74±0.70## 1 671.91±30.74## 40.47±2.62##氟西汀組 10 μmol/L 7.60±1.15?? 268.01±19.58?? 38.36±4.97空白血清組 4 10.04±1.63 1 407.85±173.19 38.65±2.77含藥血清組 4 11.55±1.97 1 635.90±69.67 36.14±7.45空白血清組 8 10.63±2.35 1 641.56±9.92 39.26±6.72含藥血清組 8 8.73±1.31?? 1 312.48±113.83??△ 28.20±7.89??△

    3.7 含藥血清對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響 表7 顯示, 與空白組比較, 模型組5-HT 水平顯著降低(P<0.05), IDO 表達(dá)顯著增加(P<0.01); 與模型組比較, 含藥血清高劑量組5-HT 水平顯著上調(diào), IDO 水平顯著下調(diào)(P<0.01), 低劑量組IDO水平顯著下調(diào)(P<0.01)。

    3.8 含藥血清對(duì)IL-6、 TNF-α mRNA 表達(dá)的影響 表8 顯 示, 與 空 白 組 比 較, 模 型 組IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)顯著增加(P<0.05, P<0.01);與模型組比較, 含藥血清組兩者mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05, P<0.01)。

    表7 含藥血清對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響(x±s, n=5~6)Tab.7 Effects of medicated serum on 5-HT and IDO levels±s, n=5-6)

    表7 含藥血清對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響(x±s, n=5~6)Tab.7 Effects of medicated serum on 5-HT and IDO levels±s, n=5-6)

    注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,??P<0.01;與空白血清低劑量組比較,▲P<0.05;與空白血清高劑量組比較,△P<0.05,△△P<0.01

    空白組 — 51.66±16.17 1.22±0.21模型組 — 29.77±11.41# 1.65±0.16##氟西汀組 10 μmol/L 57.95±13.24?? 0.79±0.18??空白血清組 4 29.52±5.37 2.04±0.64含藥血清組 4 43.77±14.92 1.12±0.14??▲空白血清組 8 20.21±4.88 2.13±0.66含藥血清組 8 74.82±8.51??△△ 1.25±0.09??△

    表8 含藥血清對(duì)IL-6、 TNF-α mRNA 表達(dá)的影響,n=4~5)Tab.8 Effects of medicated serum on IL-6 and TNF-α mRNA expressions s, n=4-5)

    表8 含藥血清對(duì)IL-6、 TNF-α mRNA 表達(dá)的影響,n=4~5)Tab.8 Effects of medicated serum on IL-6 and TNF-α mRNA expressions s, n=4-5)

    注:與空白組比較,#P <0.05,##P <0.01;與模型組比較,?P <0.05,??P<0.01;與空白血清低劑量組比較,▲▲P<0.01;與空白血清高劑量組比較,△P<0.01, △P<0.05

    空白組 — 1.04±0.40 1.20±0.38模型組 — 7.49±1.09## 9.73±2.01#氟西汀組 10 μmol/L 4.43±0.92?? 4.08±1.09空白血清組 4 5.87±1.10 7.17±0.42含藥血清組 4 1.52±0.18??▲▲ 0.86±0.30?▲▲空白血清組 8 6.09±0.58 7.06±0.76含藥血清組 8 2.15±0.14??△△ 1.07±0.03?△

    3.9 含藥血清對(duì)5-HT1A、 IDO1 mRNA 表達(dá)的影響 表9 顯示, 與空白組比較, 模型組5-HT1A mRNA 表達(dá)顯著降低(P<0.01), IDO1 mRNA 表達(dá)顯著升高(P<0.01); 與模型組比較, 含藥血清組5-HT1A mRNA 水平顯著上調(diào)(P<0.01), IDO1 mRNA 水平顯著下調(diào)(P<0.01)。

    表9 含藥血清對(duì)5-HT1A、 IDO1 mRNA 表達(dá)的影響(x±s, n=4~5)Tab.9 Effects of medicated serum on 5-HT1A and IDO1 mRNA expressionss, n=4-5)

    表9 含藥血清對(duì)5-HT1A、 IDO1 mRNA 表達(dá)的影響(x±s, n=4~5)Tab.9 Effects of medicated serum on 5-HT1A and IDO1 mRNA expressionss, n=4-5)

    注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,??P<0.01;與空白血清低劑量組比較,▲▲P <0.01;與空白血清高劑量組比較,△P <0.01,△P<0.05

    空白組 — 1.04±0.01 0.87±0.39模型組 — 0.34±0.05## 2.17±0.19##氟西汀組 10 μmol/L 0.76±0.05?? 0.99±0.30??空白血清組 4 0.35±0.03 1.92±0.17含藥血清組 4 0.57±0.09??▲▲ 0.74±0.23??▲▲空白血清組 8 0.31±0.03 1.82±0.34含藥血清組 8 0.67±0.13??△△ 1.07±0.42??△

    4 討論

    炎癥反應(yīng)參與了抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程, 細(xì)胞因子水平異常與神經(jīng)精神綜合征發(fā)生存在必然聯(lián)系[4], 炎性細(xì)胞因子會(huì)通過影響大腦神經(jīng)傳遞和可塑性來觸發(fā)氧化應(yīng)激, 抑制成年神經(jīng)發(fā)生等途徑。 從而誘發(fā)抑郁癥[5]。 脂多糖刺激機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子能激活吲哚胺2, 3-雙加氧酶(IDO), 它是一種能由IL-6、 IFN -α、 IFN -γ、 TNFα 中1 種或幾種結(jié)合的細(xì)胞因子激活若干炎癥信號(hào)通路激活的酶, 可導(dǎo)致色氨酸(TRP) 更多地代謝為犬尿氨酸(KYN), 進(jìn)而引起神經(jīng)毒性產(chǎn)物的增加, 抑制海馬神經(jīng)元的可塑性[6-7], 同時(shí)被色氨酸羥化酶 (TrpH) 和1-芳香族氨基酸脫羧酶 (LAADC) 代謝成5-HT 的色氨酸減少, 導(dǎo)致后者合成水平下降, 并引起強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長、 飛濺測(cè)試梳洗時(shí)間減少等抑郁樣行為, 給予細(xì)胞因子抑制劑米諾環(huán)素后能間接阻斷IDO 激活, 表現(xiàn)出阻止抑郁癥的發(fā)展[8]。 Corona 等[9]報(bào)道, LPS 誘導(dǎo)的IDO 激活會(huì)導(dǎo)致趨化因子受體缺陷小鼠(CX3CR1-/-小鼠) 產(chǎn)生抑郁樣行為, 小膠質(zhì)細(xì)胞激活和腦內(nèi)5-HIAA/5-HT 比率增加, 給予IDO 抑制劑1-MT 后可緩解該狀況。 另外, 非甾體抗炎藥物阿司匹林也能在通過下調(diào)細(xì)胞因子(IL-6、 TNFα) 釋放來減輕炎性反應(yīng)的同時(shí), 縮短SD 大鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間從而緩解抑郁樣行為[10]。

    逍遙散具有良好的抗抑郁作用, 方中君藥柴胡有效成分柴胡皂苷抗炎作用明顯[11], 其機(jī)制與抑制炎 癥 介 質(zhì) (IL-1、 IL-6、 TNF-α 等) 釋 放 有關(guān)[12]; 臣藥當(dāng)歸、 白芍均具有抗炎作用, 前者所含阿魏酸能提高吞噬細(xì)胞功能, 抑制IL-1β、 JNK信號(hào)通路來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用, 而后者所含芍藥苷、 牡丹酚等可抑制IL-6、 TNF-α 等炎性因子分泌; 佐藥白術(shù)、 茯苓、 生姜[13]、 薄荷[14], 以及使藥甘草[15]均可通過抑制炎癥因子釋放來發(fā)揮抗炎作用, 有效成分包括白術(shù)內(nèi)酯、 茯苓多糖、 姜黃素、 薄荷酮、 甘草黃酮等。 課題組前期采用二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)及醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn), 也發(fā)現(xiàn)逍遙散具有一定抗炎作用, 顯示出其處方藥物抗炎作用的整合表現(xiàn)。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 脂多糖刺激可引起小鼠出現(xiàn)懸尾、 強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長等抑郁樣行為, 而且小鼠血清、 皮質(zhì)、 海馬中IL-6、 TNF-α 水平明顯升高, 提示抑郁樣行為與IL-6、 TNF-α 水平升高存在一定相關(guān)性; 它也可誘導(dǎo)小鼠皮層、 海馬中IDO水平上調(diào), 5-HT 水平下降, 海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則, 細(xì)胞間隙增大, 排列不齊, 甚至尼氏小體消失, 提示該模型小鼠抑郁樣行為發(fā)生與炎性反應(yīng)有關(guān); 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示, 逍遙散能縮短模型小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、 懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間, 降低外周及中樞皮層、 海馬IL-6、 TNF-α、 IDO 水平, 提高5-HT 水平; 體外實(shí)驗(yàn)顯示, 含藥血清可對(duì)抗脂多糖誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞炎性因子異常釋放及其mRNA表達(dá), 并提高模型細(xì)胞5-HT 分泌水平及5-HT1A mRNA 的表達(dá)。

    綜上所述, 逍遙散對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥抑郁樣模型有對(duì)抗作用, 其機(jī)制可能與直接上調(diào)5-HT 水平及其受體功能, 或通過阻斷炎性因子誘導(dǎo)的IDO 激活途徑來抑制TRP-KYN 代謝途徑, 促使更多TRP 向5-HT 轉(zhuǎn)化, 并同時(shí)降低KYN 及其下游神經(jīng)元毒性代謝物的產(chǎn)生, 或保護(hù)神經(jīng)元、 促神經(jīng)元增殖分化有關(guān)。 同時(shí)也進(jìn)一步表明, 逍遙散的抗抑郁作用是多途徑、 多靶點(diǎn)模式。

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