喀斯特石漠化區(qū)植被恢復(fù)不同階段土壤真菌群落組成分析

劉雯雯，喻理飛, ，嚴令斌，劉娜，趙慶

1. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2. 山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室/山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽 550025

以貴州為中心的西南地區(qū)是喀斯特連續(xù)分布最典型的區(qū)域（盛茂銀等，2013），具有高度異質(zhì)性和脆弱性，易發(fā)生石漠化。植被退化是石漠化發(fā)展的重要原因和標(biāo)志，退化喀斯特植被自然恢復(fù)一般有六個恢復(fù)階段，即草本群落階段、灌草過渡階段、灌木灌叢階段、灌喬過渡階段、喬林階段和頂極群落階段（喻理飛等，2002），不同植被下小生境土壤分布及其理化性質(zhì)、土壤微生物存在差異（廖洪凱等，2013；廖洪凱等，2012；劉方等，2008），且與植被特征相關(guān)（Sayer et al.，2017）。

高通量測序是研究微生物群落組成的一種可靠且有效的方法（Bengtsson-Palme et al.，2013）。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）擴增子測序是研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異的重要技術(shù)手段之一，已被廣泛應(yīng)用于真菌分類鑒定中（Bachy et al.，2013；Mago? et al.，2011）?？λ固貐^(qū)不同退化階段土壤微生物類群數(shù)量、微生物群落功能多樣性（胡芳等，2018；梁月明等，2010；宋敏等，2013；譚秋錦等，2014）等已有報道。真菌群落被正式描述的群落不到10%，未確定的分類信息高。本研究采用高通量測序、ITS擴增子測序技術(shù)對喀斯特區(qū)植被恢復(fù)不同階段小生境土壤真菌進行種類鑒定與分析，闡明退化喀斯特植被恢復(fù)過程土壤真菌群落組成及優(yōu)勢關(guān)鍵類群，對深入認識喀斯特石漠化區(qū)植被恢復(fù)過程中土壤微生物作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

貴州省安順市鎮(zhèn)寧布依族苗族自治縣大山鎮(zhèn)位于貴州省西南部珠江水系與長江水系分水嶺之間（東經(jīng) 105°35′－106°1′，北緯 25°25′－26°11′）。海拔356－1678 m，巖溶地貌分布廣，占全縣面積60%以上；屬北亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，全年氣候溫和，雨量充沛；年平均氣溫 16.2 ℃，年平均日照時數(shù)為1142 h，年平均降水量1277 mm。研究區(qū)森林于 1958－1960年被采伐后，植被逐漸恢復(fù)，因存在不同干擾，研究區(qū)內(nèi)出現(xiàn)草本群落階段、灌草過渡階段、灌木林階段和喬林階段群落，植被下發(fā)育有典型的石面、石溝、石縫等小生境。喬林階段以化香（Platycarya strobilacea）、黃連木（Pistacia chinensis）、海金子（Pittosporum illicioides）、樸樹（Celtis sinensis）為優(yōu)勢種，灌木林主要有化香（Platycarya strobilacea）、針齒鐵仔（Myrsine semiserrata），灌草過渡階段主要有化香（Platycarya strobilacea）、異葉鼠李（Rhamnus heterophylla）、安順潤楠（Machilus cavaleriei），草本群落階段主要有白茅（Imperata cylindrica）、地果（Ficus tikoua）、沿階草（Ophiopogon bodinieri）、藎草（Arthraxon hispidus）。區(qū)域內(nèi)巖石裸露率為10%－60%，成土母巖為石灰?guī)r，土壤為石灰土，土壤pH介于6.9－7.9之間。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

在典型的喬林階段（F）、灌木林階段（S）、灌草過渡階段（B）、草本群落階段（G）4個不同恢復(fù)階段分別設(shè)置樣地，在喬林階段設(shè)置20 m×20 m樣地，灌木林階段樣地、灌草過渡階段設(shè)置 4 m×10 m樣地，草本群落階段樣地為2 m×5 m，每個階段設(shè)置3個樣地，共12個。每個樣地內(nèi)分別在石面（U）、石溝（D）、石縫（C）3種小生境內(nèi)采集0－10 cm表層土壤樣品，共36個。每個土樣除去石塊和動植物殘體，混合均勻后，裝于密封袋中并編號，立刻放入液氮罐中速凍，帶回實驗室放入-70 ℃冰箱中保存，用于DNA提取。樣品保存在干冰中送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。

1.2.2 DNA抽提和PCR擴增

根據(jù)土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行總 DNA 抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；選用引物 ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS2R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC進行 PCR擴增。使用ABI GeneAmp? 9700型的PCR儀，擴增體系為 20 μL，2 μL 10×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8 μL 引物（5 μM），0.2 μL rTaq聚合酶；10 ng DNA模板。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，35個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用IlluminaMiseq PE 300平臺進行測序。

1.2.3 OTU聚類和注釋

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（Su et al.，2012）對每個樣品的Reads進行拼接，得到原始Tags數(shù)據(jù)；參照QIIME的Tags質(zhì)量控制流程，經(jīng)過Tags截取、過濾及嵌合體去除等處理后得到高質(zhì)量的有效Tags數(shù)據(jù)。利用UPARSE軟件，按照97%的相似度將序列聚類為OTU（sOperational Taxonomic Units），使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋。

1.2.4 統(tǒng)計分析

利用R語言vegan包根據(jù)豐度排名前50的類群繪制熱圖，從物種和樣品兩個層面進行聚類，分析各植被恢復(fù)階段的優(yōu)勢真菌類群。通過 LEfSe（LDA Effect Size）系統(tǒng)分析植被不同恢復(fù)階段具有顯著差異的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

樣本的物種多樣性隨測序量的變化情況可由Shanon-Winner指數(shù)曲線反映，如圖 1所示，曲線趨向平坦且文庫覆蓋率高于0.99，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，足以全面反映樣本中的微生物信息。

圖1 Shanon-Winner指數(shù)曲線Fig. 1 Shannon-Winner index curves

36個土壤樣品通過高通量測序及分析共獲得2437541條有效序列（表1），每個樣品獲得35911條有效序列，OTU數(shù)目為5437，分屬于6個門、31個綱、106個目、244個科及626個屬。

表1 測序結(jié)果Table 1 Statistics of sequencing data

2.2 土壤真菌群落組成

2.2.1 門分類水平上組成

喀斯特植被下土壤真菌群落在門分類水平上主要由 4類真菌組成，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和未分類真菌（Others/Unclassified fungi），占比分別為53.39%、25.08%、6.91%、14.20%，其中子囊菌門高于30%，為優(yōu)勢菌群，擔(dān)子菌門與接合菌門占比不高但在所有樣品中均有出現(xiàn)，為常見菌群。

植被恢復(fù)不同階段土壤真菌群落門水平的組成也相同，均由子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門、未分類真菌組成，喬林階段分別占44.18%、30.66%、8.16%、16.29%，灌木林階段為49.06%、27.72%、6.36%、16.52%，灌草過渡階段為51.88%、31.89%、6.70%、8.96%，草本群落階段為68.43%、10.06%、6.40%、15.00%，可見恢復(fù)早期階段優(yōu)勢菌群子囊菌門比例高，隨植被恢復(fù)逐漸下降。

2.2.2 屬分類水平上組成

在屬分類水平上，植被恢復(fù)不同階段土壤真菌群落組成屬及相對豐度（＞1%）如表2所示，其中，相對豐度＞5%的屬在喬林階段和灌木林階段相似，青霉屬Penicillium僅在灌木階段豐度稍高。

以樣品為單元，將各樣品中豐度排名前 50的屬利用R語言繪制熱圖，得36個不同生境下土壤真菌屬水平物種豐度聚類熱圖（圖2）。圖2表明：36個樣品中除草地石面樣品（GU3）、灌草過渡階段的石縫樣品（BC2）和草本群落階段石溝樣品GD1差異較大外，其余樣品可歸為3個土壤真菌組成類型，即類型1，由SD1/SD2/FC1/SD2/FD2/SD3/FD1/FU2/SU3/SC3/FC2/SU1/FC3/SU2/BU3/FD3組成，均為喬林階段與灌木林階段樣品，類型 2由BU1/BC1/FU3/BC3/BD1/BD3組成，絕大部分為灌草過渡階段樣品，類型 3由 GC2/GD2/GU1/BU2GU2/GC1/GD3/GC3/GD2組成，絕大部分為草本群落階段樣品。以樣品為單元的分類結(jié)果與植被恢復(fù)階段屬水平的土壤真菌群落組成一致，反映出在同一恢復(fù)階段小生境引起的土壤真菌群落組成變化小于植被恢復(fù)階段的影響。

植被各恢復(fù)階段土壤真菌群落相對豐度＞5%的物種屬組成（表2）如下：（1）喬林和灌木林階段有未分類真菌（11.90%－16.53%）、Geminibasidium（7.71%－11.90%）、被孢霉屬Mortierella（6.35%－8.13%）、蠟殼耳屬Sebacina（7.60%－9.73%）、青霉屬Penicillium（4.37%－6.78%）等；（2）灌草過渡階段有蠟殼耳屬Sebacina（22.96%）、子囊菌門 Ascomycota（11.26%），Geminibasidium（7.14%）、被孢霉屬 Mortierella（6.69%）、鐮刀菌屬Fusarium（5.29%）；（3）草本群落階段有未分類真菌（15.00%）、鐮刀菌屬Fusarium（12.88%）、子囊菌門 Ascomycota（13.40%）、被孢霉屬Mortierella（6.17%）、Archaeorhizomyces（5.85%）。

表2 植被不同恢復(fù)階段土壤真菌群落組成及相對豐度Table 2 Composition and relative abundance of soil fungi in different vegetation restoration stages

圖2 植被不同恢復(fù)階段土壤真菌的屬水平物種豐度聚類熱圖Fig. 2 Heat map of genus level abundance of soil fungi in different vegetation restoration stages

2.3 關(guān)鍵真菌類群分析

LEfSe分析可用于分析組間菌群差異，找出各組間差異的微生物種類。對上述3種土壤真菌群落組成類型進行LEfSe分析（LDA值默認為4），圖3表明：導(dǎo)致喬林、灌木林階段土壤真菌群落組成（類型1）具顯著差異并起關(guān)鍵作用的優(yōu)勢關(guān)鍵物種屬是木霉屬 Trichoderma（LDA=4.11）、青霉屬Penicillium（LDA=4.35）、小蔓毛殼科Herpotrichiellaceae（LDA=4.00）、革菌科Thelephoraceae（LDA=4.10）和未分類真菌（LDA=4.86），灌草過渡階段（類型 2）是煤炱目Capnodiales（LDA=4.15）、格孢菌目 Pleosporales（LDA=4.28）、蠟殼耳屬Sebacina（LDA=5.30）、Geminibasidium（LDA=4.77），草本群落階段（類型3）是鐮刀菌屬Fusarium（LDA=4.78）、肉座菌科Hypocreales（LDA=4.54）、子囊菌門（LDA=4.63）、Archeaorhizomyces屬（LDA=4.48），支頂孢屬Acremonium（LDA=4.22）。

圖3 植被不同恢復(fù)階段土壤真菌物種LDA值分布柱狀圖Fig. 3 LDA score distrubution histogram of LEfSe analysis in different vegetation restoration stages

3 討論

3.1 喀斯特植被恢復(fù)不同階段真菌群落組成分析

利用高通量測序技術(shù)分析了喀斯特區(qū)植被恢復(fù)過程中4個階段土壤真菌群落組成結(jié)構(gòu)，物種門組成結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，優(yōu)勢真菌主要為子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門和未分類真菌；其中木霉屬 Trichoderma、青霉屬 Penicillium、小蔓毛殼科Herpotrichiellaceae、革菌科Thelephoraceae、蠟殼耳屬Sebacina、Geminibasidium、鐮刀菌屬Fusarium、Archeaorhizomyces、煤炱目Capnodiales、格孢菌目Pleosporales、子囊菌門 Ascomycota未定屬等為該地區(qū)的優(yōu)勢關(guān)鍵屬。這與曾慶飛等（2015）認為貴州高原不同石漠化程度土壤真菌優(yōu)勢菌群為球囊菌門，其優(yōu)勢屬為曲霉屬 Aspergillus、鐮刀菌屬、被孢霉屬、球囊霉屬 Glomus等的研究結(jié)果不同。對黃土高原土壤（白麗等，2018）、納帕海高原濕地（陳偉等，2018）、寧夏沙漠土壤（郭成瑾等，2017）的研究發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢真菌主要為子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門，另外還有其他豐度較低和目前數(shù)據(jù)庫無法鑒定的真菌門，其優(yōu)勢屬為赤霉菌屬Gibberella、青霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬等，可見其在門水平上與喀斯特區(qū)植被恢復(fù)過程中土壤真菌群落組成相似，但優(yōu)勢關(guān)鍵屬存在差異。

3.2 未鑒定真菌是未來深入研究的關(guān)鍵

無論是喀斯特地區(qū)，還是黃土高原、納帕海高原，土壤真菌群落組成中都存在豐度較低和目前數(shù)據(jù)庫無法鑒定的真菌門，黃土高原該類真菌占比約6.15%，納帕海高原該占比為 60%以上，本研究各植被恢復(fù)階段中門水平上的比例達 6.36%－16.52%，屬水平上的比例達8.96%－16.53%，因此，對喀斯特區(qū)土壤真菌類群庫的完善是土壤真菌鑒定及多樣性研究深入的關(guān)鍵。

3.3 喀斯特土壤真菌對參與養(yǎng)分循環(huán)吸收的影響

豐度占優(yōu)勢的類群中蠟殼耳屬 Sebacina、革菌屬 Tomentella、外瓶霉屬 Exophiala、支頂孢屬Acremonium、黑團孢屬Periconia等屬于菌根真菌，菌根真菌的生物量與其分泌的代謝物是重要的碳匯且在土壤復(fù)雜的有機質(zhì)降解過程中有重大貢獻，同時菌根真菌可利用土壤中的無機氨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有機氮等有效提高對氮源的吸收利用（郭良棟等，2013）。木霉屬 Trichoderma、鐮刀菌屬 Fusarium不僅分泌纖維素酶對碳的分解起作用，其與青霉屬Penicillium、裸節(jié)菌屬Talaromyces都參與了土壤難溶性磷的溶解，有效提高植物對磷的獲取，是溶磷微生物的重要類群（楊順等，2018）。本研究中，喬林、灌木林兩階段中菌根真菌、溶磷真菌等種類豐度高，菌根的形成促進植物對土壤磷、氮的攝取吸收，參與養(yǎng)分分解礦化、硝化作用等過程（韋莉莉等，2016），參與有機質(zhì)降解、氮循環(huán)、磷循環(huán)等養(yǎng)分循環(huán)，貢獻程度大；菌根真菌在灌草過渡階段豐度高；溶磷真菌在草本群落階段中豐度高，在活化土壤磷方面貢獻較大，增加土壤磷的供應(yīng)，促進植物吸收利用（沈仁芳等，2015）。因此，深入研究喀斯特植被恢復(fù)過程中功能微生物的作用是重要的研究方向。

4 結(jié)論

喀斯特植被恢復(fù)過程中不同階段下土壤真菌群落組成分為3種類型：

類型1為喬林和灌木林階段，由未分類真菌、Geminibasidium、被孢霉屬 Mortierella、蠟殼耳屬Sebacina、青霉屬Penicillium、子囊菌門Ascomycota等組成，其中木霉屬 Trichoderma、青霉屬Penicillium、小蔓毛殼科 Herpotrichiellaceae、革菌科 Thelephoraceae、未分類真菌為該類型的關(guān)鍵優(yōu)勢真菌類群。

類型2為灌草過渡階段，由蠟殼耳屬Sebacina、Geminibasidium、被孢霉屬 Mortierella等構(gòu)成，其中，蠟殼耳屬 Sebacina、Geminibasidium、煤炱目Capnodiales、格孢菌目 Pleosporales未定屬為該類型的關(guān)鍵優(yōu)勢真菌類群。

類型3為草本群落階段，由未分類真菌、鐮刀菌屬 Fusarium、子囊菌門 Ascomycota、被孢霉屬Mortierella、Archaeorhizomyces等構(gòu)成，鐮刀菌屬Fusarium、Archeaorhizomyces、支頂孢屬Acremonium、肉座菌科 Hypocreales、子囊菌門Ascomycota未定屬為該類型的關(guān)鍵優(yōu)勢真菌類群。