白及有效成分Militarine在肝微粒體中的體外代謝途徑及其酶促動力學(xué)特征Δ

夏濤，王昌權(quán)，陳浩，鄭林，鞏仔鵬，李月婷，李勇軍，黃勇，潘潔#

（1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽 550004）

白及為蘭科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.］的干燥塊莖，是2015年版《中國藥典》（一部）收載的常用藥材，具有收斂止血、消腫生肌的作用，可用于治療咯血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等病癥[1-2］。目前，以白及為主藥制備并上市的藥品有白百抗癆顆粒、百貝益肺膠囊、結(jié)核丸等多個(gè)品種。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白及有效部位可通過促進(jìn)血小板活化、形變、聚集、凝血來增加血液黏度，從而發(fā)揮止血作用[3-4］。Militarine為白及有效部位中含量較高的活性成分，其在白及藥材中的含量達(dá)1.45%～3.32%[5-6］。藥理研究證實(shí)，Militarine能改善慢性腦缺血模型大鼠的認(rèn)知功能障礙，減輕其腦白質(zhì)缺血性損傷，并具有舒張血管的作用[7-8］。由此可見，Militarine是一種具有藥物開發(fā)前景的天然化學(xué)成分。

藥物代謝是藥物在體內(nèi)產(chǎn)生藥效及毒性的主要過程，為篩選藥物活性成分、降低藥物研發(fā)過程中的高淘汰率，對候選化合物的代謝過程進(jìn)行基礎(chǔ)研究具有重要意義[9］。肝臟富含眾多藥物代謝酶，是藥物代謝的主要場所[10］。肝微粒體是應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)體外代謝模型，通過其獲得的藥物體外代謝特征可在一定程度上反映藥物的體內(nèi)代謝特性[11］。目前，關(guān)于Militarine的體內(nèi)過程研究鮮見報(bào)道，其吸收、分布、代謝和排泄特征尚不明確。因此，本課題組采用肝微粒體體外孵育法對Militarine進(jìn)行代謝研究，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對Militarine的代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，推測其在肝微粒體中可能的代謝途徑；并通過超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)考察Militarine在肝微粒體中代謝的酶促動力學(xué)特征，為該活性成分的代謝機(jī)制及在體藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

UHPLC-QTOF型超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站、UNIFI數(shù)據(jù)庫，美國Bruker公司）；Acquity UPLC I-Class/Xevo TQ-S型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站，美國Waters公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；NA-5L型氮空一體機(jī)（北京中興匯利科技發(fā)展有限公司）；TARGIN VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；HtPot70型恒溫孵育箱（美國ABSON科學(xué)儀器集團(tuán)）；Coulter Optima XPN-100型智能型超速離心機(jī)（美國Beckman公司）；ST40R型臺式大容量冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 藥品與試劑

Militarine對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號:ps171128-04，純度:≥98%）；葛根素對照品（內(nèi)標(biāo)，中國食品藥品檢定研究院，批號:110752-201512，純度:≥96.0%）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；人肝微粒體（武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號:M10001.2017002，蛋白濃度:20 mg/mL；于－80℃冷凍保存，臨用前用PBS稀釋至所需濃度）；還原性輔酶Ⅱ（NADPH，批號:1113N021）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）均購自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，規(guī)格:500 mL∶4.5 g；可作生理鹽水使用）；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量為（220±20）g，由湖南長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK（湘）2014-0011。動物均在室溫（23±2）℃、濕度（45±5）%的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取Militarine對照品適量，用甲醇溶解制成濃度為100 nmol/mL的對照品母液。臨用前以甲醇稀釋至所需濃度，即得。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取內(nèi)標(biāo)對照品適量，用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3NADPH溶液 精密稱取NADPH適量，以PBS溶解制成400 mg/mL（即538μmol/mL）的母液，于－80℃下保存，備用。臨用前以PBS稀釋至所需濃度。

2.2 大鼠肝微粒體的制備

取大鼠6只，禁食不禁水過夜，次日經(jīng)股動脈取血，然后處死。開腹迅速取出肝臟，用生理鹽水灌注至土黃色，以1.15%氯化鉀溶液洗滌3次，濾紙吸干后稱定質(zhì)量。將肝臟剪碎至約3 mm×3 mm×3 mm的碎片，加3倍體積（mL/g）生理鹽水，冰浴中勻漿。勻漿液在4℃條件下以3 000×g離心10 min；取上清液，以雙層紗布濾過后，在4℃條件下以12 000×g離心20 min；取上清液，繼續(xù)在4℃條件下以100 000×g離心45 min，所得沉淀即為大鼠肝微粒體。在沉淀中加入含20%甘油的生理鹽水，用移液槍吹散均勻，取適量，采用BCA試劑盒測得總蛋白質(zhì)量濃度為15 mg/mL。剩余大鼠肝微粒體于－80℃冷凍保存，臨用前以PBS稀釋至所需濃度。

2.3 Militarine在大鼠/人肝微粒中的代謝途徑考察

2.3.1色譜條件色譜柱:Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；保護(hù)柱:Waters VanGuard BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相:0.01%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，95%A；2～8 min，95%A→2%A；8～10 min，2%A；10～12 min，2%A→95%A）；流速:0.4 mL/min；柱溫:35 ℃；進(jìn)樣量:1 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；掃描方式:負(fù)離子掃描（ESI－）；質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍:50～1 200；毛細(xì)管電壓:1.5 kV；離子源溫度:100℃；錐孔電壓：30 V；脫溶劑氣溫度：300℃；錐孔氣流量:50 L/h；碰撞能量:20～30 eV；脫溶劑氣流量:10 L/min；數(shù)據(jù)采集模式:全信息串聯(lián)質(zhì)譜；甲酸鈉校正，校正模式:Sensitivity。

2.3.3 Militarine在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物測定（1）孵育條件:在離心管中加入大鼠肝微粒體溶液100 μL（蛋白終濃度為1 mg/mL，下同）、PBS 48 μL、50 nmol/mL的Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL（作為樣品組），于37℃下預(yù)孵育5 min；然后加入1μmol/mL NADPH溶液40 μL啟動反應(yīng)。分別于反應(yīng)0、10、30、60、120 min時(shí)，加入預(yù)冷的甲醇200 μL并立即在－20℃條件下凍存30 min以終止反應(yīng)。同時(shí)設(shè)置空白組和對照組，空白組除不加入Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液、對照組除加入滅活的大鼠肝微粒體（加適量甲醇滅活）之外，其余操作相同，并分別于反應(yīng)0、120 min后終止反應(yīng)。（2）代謝產(chǎn)物測定:將反應(yīng)液渦旋混勻3 min，超聲（功率:300 W，頻率:50 kHz）5 min，5 000 r/min離心5 min；取上清液，于37 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)?0%甲醇200μL復(fù)溶，按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件測定。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均采用雙樣本分析。

2.3.4 Militarine在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物測定 取凍存的人肝微粒體溶液，于4℃下自然解凍、稀釋后，按“2.3.3”項(xiàng)下方法同步操作，進(jìn)行分組體外孵育反應(yīng)及代謝產(chǎn)物測定。

2.3.5 Militarine的代謝途徑分析 經(jīng)MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站對“2.3.3”“2.3.4”項(xiàng)下測定結(jié)果進(jìn)行分析與處理，Militarine在不同組大鼠/人肝微粒體中代謝120 min時(shí)的總離子流圖見圖1、圖2。結(jié)果顯示，Militarine及其代謝產(chǎn)物在ESI－模式下響應(yīng)較好，結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫并參考文獻(xiàn)[12-13］后認(rèn)為，在保留時(shí)間4.44 min處出現(xiàn)的m/z725.268 1[M-H］－峰所對應(yīng)的化合物可能為Militarine，而在4.18 min處出現(xiàn)的m/z457.174 1[M-H-C13H16O6］－峰與Militarine對照品的主要碎片離子峰保留時(shí)間一致。由此確定，保留時(shí)間為4.44 min的峰（Y1）對應(yīng)化合物為Militarine；而對于保留時(shí)間為4.18 min的峰（M1），采用Single Mass Analysis功能模塊預(yù)測其對應(yīng)化合物的化學(xué)式為C21H29O11。據(jù)此推測，M1可能為Militarine的酯鍵水解代謝產(chǎn)物。Militarine在肝微粒體中的可能代謝途徑見圖3。

圖1 Militarine在大鼠肝微粒體中代謝120 min時(shí)的總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms of the metabolites of Militarine in rat liver microsomes for 120 min

2.4 Militarine在大鼠肝微粒體中的酶促動力學(xué)考察

2.4.1色譜條件色譜柱:Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相:0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，90%A；0.5～1 min，90%A→10%A；1～2 min，10%A；2～3 min，10%A→90%A）；流速:0.3 mL/min；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量：1μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 ESI；毛細(xì)管電壓：3 kV；離子源溫度：150℃；去溶劑氣溫度：600℃；去溶劑氣:氮?dú)?，流?1 000 L/h；反吹氣:氮?dú)?，流?50 L/h；碰撞氣:氬氣，流速:0.16 mL/min；掃描方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）。

圖2 Militarine在人肝微粒體中代謝120 min時(shí)的總離子流圖Fig 2 Total ion chromatograms of the metabolites of Militarine in human liver microsomes for 120 min

圖3 Militarine在大鼠和人肝微粒體中的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig 3 Biotransformation pathway of Militarine in rat and human liver microsomes

2.4.3 方法學(xué)考察 （1）專屬性考察。參照“2.3.3（1）”項(xiàng)下體外孵育條件，取空白大鼠肝微粒體100 μL，加甲醇200 μL滅活，除不加入Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液外，其余同法操作，孵育反應(yīng)60 min，得空白組樣品。另取空白大鼠滅活或不滅活肝微粒體100 μL，均分別加入 50 μmol/L 的 Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液 2 μL、內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，同法操作，作為對照組樣品和樣品組樣品。然后按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件測定。結(jié)果顯示，Militarine與其他峰之間的分離度良好；Militarine與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.33、1.27 min（圖略）。

（2）線性關(guān)系考察。取空白大鼠肝微粒體100 μL，加入適量甲醇滅活，再加入系列不同濃度的Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL（終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1、5、10、15 nmol/mL）、內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，參照“2.3.3（1）”項(xiàng)下體外孵育條件，孵育反應(yīng)60 min，再按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件測定。以待測物濃度為橫坐標(biāo)（x）、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1 232.1x+0.081（r＝0.999 9），表明Militarine濃度在0.001～15 nmol/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（3）提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察。按“2.4.3（2）”項(xiàng)下方法分別配制含Militarine低、中、高濃度（終濃度分別為0.001、1、10 nmol/mL）的大鼠肝微粒體孵育體系質(zhì)控（QC）樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，平行6份操作，參照“2.3.3（1）”項(xiàng)下體外孵育條件進(jìn)行反應(yīng)，得樣品A。另配制空白滅活大鼠微粒體孵育體系，除不加Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液外，同法進(jìn)行孵育反應(yīng)，然后向沉淀蛋白后的上清液中加入相應(yīng)低、中、高濃度的Militarine溶液與內(nèi)標(biāo)溶液，得樣品B。另以初始流動相配制對應(yīng)濃度的Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液，作為樣品C。分別按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件測定，計(jì)算樣品A與樣品B的峰面積之比，作為提取回收率；計(jì)算樣品B與樣品C的色譜峰面積之比，作為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，低、中、高濃度Militarine的提取回收率為87.01%～99.29%，基質(zhì)效應(yīng)為91.18%～99.92%。

（4）準(zhǔn)確度和精密度考察。按“2.4.3（3）”項(xiàng)下方法分別配制含Militarine低、中、高濃度的QC樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，平行6份操作，參照“2.3.3（1）”項(xiàng)下體外孵育條件進(jìn)行反應(yīng)，連續(xù)測定2 d；同時(shí)建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度。將測得值與QC樣品理論值相比較，以其百分比評價(jià)方法準(zhǔn)確度；同時(shí)，對測得值進(jìn)行比較以評價(jià)方法精密度。結(jié)果顯示，低、中、高濃度樣品準(zhǔn)確度為80.24%～99.19%，測得值的RSD值均小于10%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均良好。

（5）穩(wěn)定性考察。按“2.4.3（3）”項(xiàng)下方法分別配制含Militarine低、中、高濃度的QC樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，平行6份操作，參照“2.3.3（1）”項(xiàng)下體外孵育條件進(jìn)行反應(yīng)。然后在室溫下放置0、12 h時(shí)分別進(jìn)樣測定。另配制低、中、高濃度QC樣品，分別在4℃下冷藏24 h、－20℃冷凍-融化循環(huán)3次，同法孵育反應(yīng)后測定。結(jié)果顯示，Militarine在上述條件下放置后測得值的RSD值均小于10%，表明其穩(wěn)定性良好。

2.4.4 孵育條件優(yōu)化 參照“2.3.3（1）”項(xiàng)下體外孵育條件，考察不同蛋白終濃度（0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）和不同孵育時(shí)間（0、10、20、30、60、90 min）對Militarine（固定加入50 nmol/mL Militarine標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL）代謝的影響，優(yōu)化其孵育條件。分別以蛋白濃度和孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)、Militarine在微粒體中代謝轉(zhuǎn)化量（Militarine初始濃度為C0，終止反應(yīng)后測定濃度為Ct，代謝轉(zhuǎn)化量為C0－Ct）為縱坐標(biāo)，經(jīng)GraphPad Prism 5.0軟件擬合代謝轉(zhuǎn)化曲線（見圖4）。結(jié)果顯示，Militarine的代謝轉(zhuǎn)化量隨微粒體蛋白濃度增大而增加；而隨著孵育時(shí)間延長，其代謝轉(zhuǎn)化量先增加，后逐漸趨于飽和。因此，選擇蛋白濃度0.5 mg/mL、孵育時(shí)間30 min作為最佳孵育條件進(jìn)行酶促動力學(xué)試驗(yàn)。

圖4 Militarine在大鼠肝微粒體中的代謝轉(zhuǎn)化曲線Fig 4 Metabolic transformation curves of Militarine in rat liver microsomes

2.4.5 酶促動力學(xué)考察 為考察Militarine的酶促反應(yīng)是否依賴于NADPH，故分為NADPH組和NADPH陰性組進(jìn)行考察。參照“2.3.3（1）”項(xiàng)下體外孵育條件操作，配制含不同濃度Militarine的孵育體系（終濃度分別為 0.005、0.01、0.25、0.5、0.1、0.25、0.5、0.75、1、5、10 nmol/mL，并確保反應(yīng)體系中甲醇的體積分?jǐn)?shù)≤1%），除加入或不加入NADPH外，其他條件相同，孵育60 min后終止反應(yīng)。其中NADPH組的反應(yīng)以加入NADPH時(shí)開始計(jì)時(shí)，NADPH陰性組（加入等體積PBS代替NADPH溶液）的反應(yīng)以加入Militarine時(shí)開始計(jì)時(shí)。反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液渦混3 min，在4℃下15 000 r/min離心5 min，取上清液，按照“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件測定。以Militarine的濃度（S）為橫坐標(biāo)、Militarine的清除速率（v）為縱坐標(biāo)繪制酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線。根據(jù)米氏方程v＝vmax×S/（km+S），采用規(guī)劃求解的方法計(jì)算最大清除速率（vmax）、米氏常數(shù)（km）和固有清除率（CLint，計(jì)算公式為:CLint＝vmax/km）。Militarine的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1，NADPH組和NADPH陰性組Militarine酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線分別見圖5、圖6。經(jīng)SPSS 24統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，采用t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，Militarine在有/無NADPH參與的反應(yīng)條件下，其CLint差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明其體外代謝不依賴于由NADPH啟動的細(xì)胞色素P450（CYP）酶代謝途徑，推測可能是經(jīng)由肝微粒體中其他水解酶代謝。

表1 Militarine的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Tab 1 Kinetic parameters of Militarine enzymatic reaction

圖5 NADPH組Militarine酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線Fig 5 Kinetic curves of Militarine enzyme reaction in NADPH group

圖6 NADPH陰性組Militarine酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線Fig 6 Kinetic curves of Militarine enzyme reaction in NADPH negative group

3 討論

肝臟是藥物重要和主要的代謝器官，是藥物發(fā)生生物轉(zhuǎn)化的重要場所，因其富含藥物代謝酶系統(tǒng)，故參與了大部分藥物的體內(nèi)代謝過程，因此藥物的體外代謝模型主要以肝臟為基礎(chǔ)。體外代謝研究具有排除體內(nèi)代謝諸多干擾因素，為體內(nèi)代謝研究提供可靠的理論依據(jù)，且不消耗大量的實(shí)驗(yàn)動物和樣品等優(yōu)點(diǎn)，在藥物代謝研究中得以廣泛的應(yīng)用[14-15］。肝微粒體體外溫孵試驗(yàn)是采用從肝臟中獲取的肝微粒體，在體外模擬生理環(huán)境條件下進(jìn)行的代謝反應(yīng)，該方法代謝過程快、結(jié)果重現(xiàn)性好，便于收集和積累代謝樣品供代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證研究，在實(shí)際工作中得到普遍運(yùn)用[11］。

藥物在肝臟中的代謝分為Ⅰ相代謝（生物轉(zhuǎn)化）和Ⅱ相代謝（結(jié)合反應(yīng)），Ⅰ相代謝包括氧化、還原和水解，其中最主要的酶促反應(yīng)為氧化反應(yīng)，其次是還原和水解反應(yīng)[16］。水解反應(yīng)相關(guān)的酶主要為酯酶和過氧化物水解酶，其中酯酶介導(dǎo)的水解反應(yīng)包括酯類、酰胺類、肼類和氨基甲酸鹽類化合物的水解，主要發(fā)生在血漿（由非特異性乙酰膽堿酯酶、假膽堿酯酶和其他酯酶催化）和肝臟（由作用于特異性化合物的酯酶催化）中，而過氧化物水解酶主要催化混合功能氧化酶系反應(yīng)生成的過氧化代謝物[17］。Militarine是從白及中分離得到的單體，為丁二酸芐酯苷類化合物，是由2-異丁基蘋果酸與4-葡萄糖基芐醇形成的雙酯類衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中C1、C4位存在的兩個(gè)酯鍵使其極易發(fā)生水解反應(yīng)[11］。本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別對Militarine經(jīng)大鼠或人肝微粒體體外孵育后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒定，利用其質(zhì)譜碎片離子信息對主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定；同時(shí)，建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定Militarine含量的方法，該方法的專屬性、回收率、精密度、穩(wěn)定性較好，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，可為Militarine體內(nèi)過程的定量分析提供技術(shù)支持。

本研究結(jié)果顯示，Militarine能在肝微粒體中代謝，主要代謝產(chǎn)物M1為Militarine酯鍵水解產(chǎn)物。但Militarine可分別在C1、C4位發(fā)生酯鍵水解，所產(chǎn)生兩個(gè)代謝產(chǎn)物互為同分異構(gòu)體，具有相同分子式、碎片離子等信息，因此在缺乏M1對照品的情況下，本研究尚無法確定水解發(fā)生在C1位還是C4位，所生成的到底是哪一個(gè)代謝產(chǎn)物還需進(jìn)一步研究。但能夠明確的是，Militarine在肝臟中的代謝為酯鍵斷裂，所得代謝產(chǎn)物化學(xué)式預(yù)測為C21H29O11。

vmax、km和CLint為酶促動力學(xué)的主要參數(shù)，其中vmax值反映的是酶對底物的最大反應(yīng)效力和酶促反應(yīng)速度的快慢[18］；km值代表了酶對底物的親和能力，該值越大，則提示酶對底物的親和能力越弱；CLint則反映了酶對底物的清除能力，該值越大，則提示酶對底物的清除能力越強(qiáng)[15］。本研究通過考察Militarine的酶促反應(yīng)動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，NADPH參與或不參與的酶促反應(yīng)的CLint值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明Militarine在肝微粒體中的代謝不依賴于由NADPH啟動反應(yīng)的CYP酶代謝途徑，推測其可能經(jīng)由肝微粒體中其他水解酶途徑代謝。

綜上所述，白及有效成分Militarine在肝微粒體中代謝的主要途徑為C1、C4位酯鍵的水解，且并不依賴于由NADPH啟動的CYP酶代謝途徑。