生后營(yíng)養(yǎng)過剩對(duì)雌性SD大鼠生長(zhǎng)的影響

陳丹純，唐本玉，郭 蕾，李茵雅，李 丹，林 娟，朱順葉

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院兒科，廣東廣州510630）

社會(huì)的進(jìn)步與物質(zhì)的豐富讓人們更加關(guān)注兒童的營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)發(fā)育等問題。生命早期營(yíng)養(yǎng)的質(zhì)量以及營(yíng)養(yǎng)的變化可能會(huì)永久性地影響器官乃至系統(tǒng)的成熟，并且與生后的一些非傳染性疾病（尤其是高血壓等心血管疾病，糖尿病、胰島素抵抗等代謝紊亂和碳水化合物不耐受等疾?。┐嬖谂c否相關(guān)［1-3］。國內(nèi)外研究均表明生命早期營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)與后續(xù)健康息息相關(guān)，但關(guān)于宮內(nèi)發(fā)育遲緩生后營(yíng)養(yǎng)是否過剩對(duì)后續(xù)生長(zhǎng)影響的研究相對(duì)匱乏。因此，本研究通過孕期限食法建立宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型；采用哺乳期小窩模型［4］及斷乳后45%脂肪供能的高脂飼料［5］的方法，創(chuàng)造生后營(yíng)養(yǎng)過剩條件，旨在研究生后營(yíng)養(yǎng)過剩對(duì)生后生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠（雌性30只，體質(zhì)量230～280 g；雄性15只，體質(zhì)量280～320 g），購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)SCXK（粵）2016-0029）。普通飼料由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0010。高脂飼料由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可編號(hào)SCXK（粵）2013-0002。原材料包括：酪蛋白、蛋白、L-胱氨酸、玉米淀粉、麥芽糖糊精、蔗糖、纖維素、豆油、礦物質(zhì)AIN-93、維生素AIN-93及氯化膽堿；各組飼料成分含量比及占總熱能百分比為：碳水化合物35%，脂肪45%，蛋白質(zhì)20%，總熱量4.73 kcal/g。飼養(yǎng)條件：屏障環(huán)境中，溫度20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，分籠飼養(yǎng)，均自由攝水，自由攝食（除實(shí)驗(yàn)條件要求）。本次研究經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)批號(hào)為IACUC-DB-2017-0913。

1.1.2 藥物與試劑 過氧化物酶法血糖濃度測(cè)定試劑盒、血清IGF-1、IGF-BP3、胰島素ELISA試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；10%水合氯醛購自廣州廣譽(yù)生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動(dòng)物模型 將實(shí)驗(yàn)SD（Sprague Dawley）大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將雌雄鼠隨機(jī)按2∶1（雌鼠30只，雄鼠15只）合籠交配，合籠第2天起每天做雌鼠陰道分泌物涂片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，以陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子為受孕第1天。確認(rèn)受孕后，將受孕父母代雌鼠隨機(jī)分為限食組和正常飲食組，且均單只單籠喂養(yǎng)，自由攝食攝水；受孕第7天起，限食組雌鼠每日每只飼料5～7 g喂養(yǎng)，自由攝水；正常飲食組雌鼠仍自由攝食攝水。分娩后，從限食組選擇體質(zhì)量較對(duì)照組平均體質(zhì)量低2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或以上的子代大鼠作為宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠模型。以體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)位于正常對(duì)照組平均身長(zhǎng)及體質(zhì)量-2SD（標(biāo)準(zhǔn)差）以上者，定義為發(fā)生追趕。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 分別選擇58只子代雌性IUGR大鼠作為宮內(nèi)發(fā)育遲緩組（即I組），58只對(duì)照組子代雌性大鼠作為宮內(nèi)正常發(fā)育組（即C組）；再將宮內(nèi)發(fā)育遲緩組隨機(jī)分為小窩組（S組，4只一籠，n=28）和對(duì)照組（C組 10只一籠，n=30），即IS組、IC組；對(duì)照組隨機(jī)分為小窩組（S組，4只一籠，n=28）和對(duì)照組（C組 10只一籠，n=30），即CS組、CC組。每籠配一只父母代哺乳雌鼠，子代大鼠自由攝水，父母代雌鼠自由攝食攝水，哺乳21 d后斷乳。斷乳后父母代雌鼠與子代雌鼠分籠飼養(yǎng)，其中IS組與CS組繼續(xù)原4只一籠飼養(yǎng)，IC組與CC組分別隨機(jī)分為4只一籠飼養(yǎng)。另，IS組、CS組均予以高脂飼料喂養(yǎng)，IC組、CC組均予以普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 觀察指標(biāo) ①每周測(cè)量子代雌鼠體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)，并記錄；②在大鼠各生長(zhǎng)發(fā)育期（生后21、35、45和75 d）從各組中取出6～8只大鼠，禁食12 h，依次稱重記錄后，予以3～5 mL/kg水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，開腹行腹主動(dòng)脈取血，后采用過氧化物酶法測(cè)大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），ELISA法檢測(cè)外周血空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）及胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor binding protein 3，IGF-BP3）；③計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）：ISI=ln［1000/（FINS×FBG）］；其中，F(xiàn)INS為空腹胰島素（mU/L），F(xiàn)BG為空腹血糖（mmol/L）［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分析的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均保留至小數(shù)點(diǎn)后3位。各組之間的差異比較，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，采用兩組間t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用兩組間秩和檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料數(shù)據(jù)比較，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)或方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。變量間采用多元線性回歸分析（逐步法），以FINS、FBG、ISI、IGF-1及IGF-BP3等指標(biāo)分別為因變量，以發(fā)育周期、宮內(nèi)發(fā)育情況、生后喂養(yǎng)情況等指標(biāo)為自變量。均設(shè)定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠出生體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)箱式圖Fig.1 Birth weight and birth length of rats in each group

2 結(jié)果

2.1 宮內(nèi)發(fā)育情況對(duì)大鼠出生狀態(tài)及體格發(fā)育的影響

觀察宮內(nèi)發(fā)育遲緩的仔鼠生后行動(dòng)較遲緩，皮膚光澤稍暗，吮乳反應(yīng)較遲鈍，對(duì)照組大鼠行動(dòng)敏捷，皮膚光滑，膘肥體壯，吮乳反應(yīng)良好。CC組與CS組出生體質(zhì)量及出生鼻肛長(zhǎng)均數(shù)分別比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IC組與IS組出生體質(zhì)量及出生鼻肛長(zhǎng)均數(shù)分別比較，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。而IC組及IS組的出生體質(zhì)量均比CC組出生體質(zhì)量低2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，提示宮內(nèi)發(fā)育遲緩（IUGR）大鼠造模成功。

2.2 哺乳期小窩喂養(yǎng)和斷乳后高脂飲食對(duì)大鼠體格發(fā)育的影響

各組大鼠出生后每周測(cè)量其體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)，IS組大鼠在生后第1周體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)即追趕甚至超過了CC組（P＜0.05，圖2），其體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)明顯高于IC組，且差異隨著周數(shù)的增長(zhǎng)而變得明顯（P ＜0.05，圖2）；IC組大鼠的生后第2周，體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)相較于CC組大鼠實(shí)現(xiàn)了追趕，以后兩組每周的體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。另外，CS組大鼠的體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)均隨著周數(shù)的增大，分別與CC組大鼠體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)的差異愈發(fā)明顯（P＜0.05，圖2）。說明宮內(nèi)發(fā)育遲緩生后正常飲食的大鼠亦可實(shí)現(xiàn)了體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)的追趕，但宮內(nèi)發(fā)育遲緩生后營(yíng)養(yǎng)過剩，不僅可使IS組較IC組在更短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)的追趕，且明顯超過IC組；另外，正常宮內(nèi)發(fā)育的大鼠生后的營(yíng)養(yǎng)過剩，使得CS組生后每周的體質(zhì)量及鼻肛長(zhǎng)隨著營(yíng)養(yǎng)的增加，逐漸超過CC組。

2.3 不同發(fā)育周期各組大鼠血清空腹胰島素、空腹血糖、IGF-1和IGF-BP3水平的比較

表1可見，將宮內(nèi)發(fā)育情況、生后喂養(yǎng)情況、發(fā)育周期作為自變量，將FINS、FBG、ISI、IGF-1、IGF-BP3分別作為因變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，對(duì)于 FINS、FBG、IGF-1和 IGF-BP3，有直線關(guān)系的均只為生后喂養(yǎng)情況，且回歸系數(shù)為正值（P＜0.05，表1）；ISI而言，也僅跟生后喂養(yǎng)情況具有直線關(guān)系（P＜0.05，表1），回歸系數(shù)為負(fù)值。即表明，生后營(yíng)養(yǎng)過?？蓪?duì)血清FINS、FBG、IGF-1、IGF-BP3產(chǎn)生正向影響，而對(duì)ISI產(chǎn)生反向影響。

圖2 各組大鼠體質(zhì)量和鼻肛長(zhǎng)增長(zhǎng)趨勢(shì)圖Fig.2 Body weight and body length trend

以上為線性回歸分析結(jié)果，為了進(jìn)一步表明各組間各指標(biāo)之間的差異，繪制柱狀圖如下：

進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，IS組血清胰島素及血糖在不同發(fā)育期均明顯高于IC組（P＜0.05，圖3A-C），即IS組在不同發(fā)育周期均出現(xiàn)了胰島素且血糖升高，觀察胰島素敏感指數(shù)亦可發(fā)現(xiàn)，IS組的ISI明顯低于IC組（P ＜0.05，圖3A-C）；CS組的血清胰島素及血糖在生后75天高于CC組，即成年期出現(xiàn)了胰島素和血糖比對(duì)照組升高的情況，同時(shí)在生后75天亦出現(xiàn)ISI水平的降低。

IS組的IGF-1及IGF-BP3水平在不同發(fā)育周期均較IC組高（P＜0.05，圖3D-E）；而CC組與CS組、CC組與IC組在不同發(fā)育周期中，IGF-1及IGF-BP3水平差距不明顯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析亦提示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3D-E）。

表1 各指標(biāo)線性回歸分析結(jié)果Table 1 Regression analysis of various indicators

3 討論

宮內(nèi)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)情況直接影響仔鼠出生時(shí)的體格發(fā)育指標(biāo)。宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的限制不僅使出生仔鼠體質(zhì)量下降，鼻肛長(zhǎng)縮短，并且影響了仔鼠的狀態(tài)、行動(dòng)以及反應(yīng)。多項(xiàng)研究表明，出生時(shí)的低體質(zhì)量與成人后的多種心血管疾病及糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)［7］，因此宮內(nèi)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需要格外關(guān)注。

無論是宮內(nèi)發(fā)育正常組還是宮內(nèi)發(fā)育遲緩組，生后的營(yíng)養(yǎng)過剩，均可引起體質(zhì)量和鼻肛長(zhǎng)相比生后正常喂養(yǎng)的大鼠同期時(shí)增加。提示無論宮內(nèi)發(fā)育遲緩與否，生后早期的營(yíng)養(yǎng)過?？杉铀偕L(zhǎng)發(fā)育，生后營(yíng)養(yǎng)是生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。而IUGR大鼠中，生后營(yíng)養(yǎng)過剩的大鼠和普通喂養(yǎng)的大鼠均出現(xiàn)了生長(zhǎng)性追趕，但生后普通喂養(yǎng)的大鼠實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)追趕的時(shí)間較營(yíng)養(yǎng)過剩的大鼠推遲一周。提示IUGR大鼠生后即使普通正常喂養(yǎng)，也可實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)追趕，最終成年時(shí)還是可達(dá)到總體的平均水平。臨床資料表明，大多數(shù)的SGA患兒生后早期可出現(xiàn)快速的生長(zhǎng)追趕［8］。

圖3 各組大鼠血清各指標(biāo)水平誤差條形圖Fig.3 Error bars of serum indicators in rats of each group

IGF-1對(duì)正常的胎兒和胎盤生長(zhǎng)和分化至關(guān)重要，且與生后的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)；IUGR被認(rèn)為是IGF-1缺乏的新病癥［9］。生后IGF-1水平與幼年期的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)［10］。IGF-BP3有運(yùn)送和調(diào)節(jié)IGF-1的功能，其合成受GH-IGF軸的調(diào)控，因此IGF-1及IGF-BP3均為反映GH-IGF軸功能的指標(biāo)，機(jī)體通過GH-IGF軸的調(diào)節(jié)促進(jìn)體格生長(zhǎng)［11］。研究結(jié)果顯示，IUGR大鼠中，生后營(yíng)養(yǎng)過剩的大鼠在各個(gè)不同發(fā)育期的IGF-1及IGF-BP3水平均較生后正常喂養(yǎng)的大鼠高；而在宮內(nèi)發(fā)育正常的大鼠中，無論生后正常喂養(yǎng)還是高脂喂養(yǎng)，IGF-1及IGF-BP3均無差異。提示IUGR大鼠可能在宮內(nèi)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)代謝途徑的調(diào)整來適應(yīng)慢性營(yíng)養(yǎng)不足，且生后可適應(yīng)正常喂養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)追趕性生長(zhǎng)；過高的能量供給導(dǎo)致IGF-1和IGF-BP3升高，可實(shí)現(xiàn)快速的生長(zhǎng)追趕。但在快速追趕的同時(shí)，因?qū)m內(nèi)代謝途徑的調(diào)整導(dǎo)致生后在過度喂養(yǎng)的情況下，儲(chǔ)存盡可能多的能量，最終引起代謝紊亂，與Roth等［12］研究結(jié)果一致。

在SGA患兒中低出生體質(zhì)量狀態(tài)與胰島素抵抗相關(guān)，而生后第一年的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)和胰島素抵抗無關(guān)，是否發(fā)生追趕與胰島素抵抗無關(guān)，SGA患兒的胰島素抵抗是宮內(nèi)就存在的，并持續(xù)到生后一段時(shí)間［13］。但也有研究［14-15］認(rèn)為，小于胎齡兒臍帶血的胰島素水平與適于胎齡兒嬰兒的臍帶血胰島素水平無差異，IUGR患兒在新生兒期就可出現(xiàn)胰島素水平的升高及胰島素敏感度的下降。國內(nèi)更多研究［16］認(rèn)為SGA患兒出現(xiàn)生長(zhǎng)追趕后，有胰島素抵抗的傾向，且胰島素抵抗程度與生長(zhǎng)追趕程度相隨，而未出現(xiàn)生長(zhǎng)追趕的并未出現(xiàn)胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)，IUGR大鼠中生后營(yíng)養(yǎng)過剩的大鼠較生后正常喂養(yǎng)的大鼠在各個(gè)發(fā)育期，均出現(xiàn)了空腹胰島素、空腹血糖水平的同步增高，且ISI水平下降；而在宮內(nèi)發(fā)育正常的大鼠中，生后營(yíng)養(yǎng)過剩的大鼠僅在生后75 d（即成年期）出現(xiàn)空腹胰島素和空腹血糖水平的增高，ISI的下降。經(jīng)多元線性回歸分析亦表明，生后營(yíng)養(yǎng)過?？蓪?duì)FINS、FBG、IGF-1、IGF-BP3的升高產(chǎn)生促進(jìn)作用，而對(duì)胰島素敏感性產(chǎn)生抑制作用。

綜上，本研究中宮內(nèi)發(fā)育遲緩的大鼠均實(shí)現(xiàn)了生長(zhǎng)性追趕，生后營(yíng)養(yǎng)過剩的大鼠出現(xiàn)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期的胰島素敏感指數(shù)下降。我們推測(cè)，小于胎齡兒生后正常的喂養(yǎng)，其可通過自身調(diào)整來達(dá)到生長(zhǎng)追趕，同時(shí)不出現(xiàn)胰島素敏感性下降；而生后營(yíng)養(yǎng)過剩，無論宮內(nèi)發(fā)育遲緩與否，均可能導(dǎo)致胰島素敏感性下降，且對(duì)于IUGR大鼠，胰島素敏感性下降可貫穿整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期及成年期，而宮內(nèi)發(fā)育正常的大鼠僅在成年期出現(xiàn)，即宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)于高能量飲食的適應(yīng)力更差，其需要付出更大程度代謝紊亂的代價(jià)來調(diào)整機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。我們建議，在臨床中無論是宮內(nèi)發(fā)育正常還是宮內(nèi)發(fā)育遲緩的兒童，均需要更加關(guān)注生后的營(yíng)養(yǎng)，防止?fàn)I養(yǎng)過剩引起幼兒期或成年期發(fā)生代謝性紊亂，影響生命質(zhì)量；IUGR生后正常喂養(yǎng)的大鼠也可實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)追趕且未出現(xiàn)胰島素敏感性下降，因此對(duì)于小于胎齡兒需要定期監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育情況，及時(shí)評(píng)估決定是否干預(yù)，在保證適度的生長(zhǎng)追趕同時(shí)減少日后代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)。孕母需要科學(xué)妊娠，預(yù)防IUGR發(fā)生。