間充質(zhì)干細(xì)胞通過誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞治療急性肺損傷

孫 瑤，呂海金，易小猛，郭 俊，易慧敏

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院外科ICU，廣東 廣州 510630）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和/或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由多種病因?qū)е碌囊环N危重性呼吸衰竭，是常見的危重癥之一［1-2］，缺乏有效的治療手段，病死率高達(dá)30%～40%［3-4］。因此，尋找一種新的有效的治療手段十分有必要。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有自我更新及多向分化能力［5］，免疫原性低，有著強(qiáng)大的免疫抑制功能及抗炎能力，被應(yīng)用到各種疾病的治療研究中。目前已經(jīng)有許多研究證明在各種急性肺損傷動物模型中，MSC可以提高存活率，增強(qiáng)細(xì)菌清除能力，能有效減輕肺部炎癥，緩解急性肺損傷［6-7］。但其治療及保護(hù)的具體機(jī)制目前仍不是很清楚。急性肺損傷時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞是呼吸道的重要防線，也是損傷時(shí)的主要效應(yīng)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的極化一般分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用，一般在急性炎癥期占主要部分，可以由脂多糖（LPS）和γ-干擾素（IFN-γ）單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)極化，能產(chǎn)生促炎因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）等。M2型巨噬細(xì)胞具有抑炎作用，可以由白介素4（IL-4）誘導(dǎo)極化，能產(chǎn)生抑炎因子白介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β），一般在炎癥消散期占主要部分［8-9］。當(dāng)小鼠巨噬細(xì)胞向M1型極化時(shí)，可以使其誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和CD86的表達(dá)上調(diào)，向M2型極化時(shí)可以使CD206和Arg1的表達(dá)上調(diào)。從富含M1的巨噬細(xì)胞向富含M2的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移可減輕炎癥過程，促進(jìn)組織修復(fù)和再生?？刂品尾康倪^度炎癥反應(yīng)，維持促炎反應(yīng)和抑炎反應(yīng)平衡在急性肺損傷的治療中起關(guān)鍵作用［10］。那么在MSC治療過程中對肺泡巨噬細(xì)胞的狀態(tài)是否有影響呢，是否可以通過調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞的極化發(fā)揮治療效果呢。本研究探究MSC在治療急性肺損傷時(shí)對肺泡巨噬細(xì)胞的影響，為治療方向提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡，SPF級balb/c雄性小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。實(shí)驗(yàn)動物的管理及處置遵循廣東省動物管理委員會準(zhǔn)則及動物福利準(zhǔn)則。

1.1.2 儀器 多維高清流式細(xì)胞分析儀（BD，LSRFortessa）；熒光定量PCR儀（羅氏 LightCycler96）；Transwell小室（Millipore，0.4 μm）；顯微手術(shù)器械（廣州醫(yī)藥公司醫(yī)療器械批發(fā)中心）；動靜脈穿刺針（德國貝朗，18～20 g）。

1.1.3 試劑 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（Sigma，L4524）；anti-mouse流式抗體 F4/80 APC（BioLegend，123116）、CD86 PE（BioLegend，105007）、CD206 FITC（BioLegend，141704）、INOS（BioLegend）；anti-human 流式抗體 CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD166、CD44（BD）；qPCR 引物（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）；吲哚美辛［前列腺素E2（PGE2）抑制劑］、LY2157299［轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）抑制劑］、NLG-8189［2，3雙加氧酶（IDO）抑制劑）（Sigma）；mouse ELISA KIT，TNF-α（eBioscience/BMS607）。

1.2 人臍帶MSC的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 人臍帶MSC的分離、培養(yǎng) 在產(chǎn)婦及其家屬知情同意下及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)下，無菌條件下獲取健康足月剖宮產(chǎn)臍帶5～8 cm。沖洗干凈，剔除臍靜脈及臍動脈后，剪碎成約1 mm3的小塊。取適量組織小塊到10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 mL MSC完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待有細(xì)胞爬出貼壁時(shí)，更換培養(yǎng)基，1周后取出組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合到80%～90%，按1∶3比例進(jìn)行傳代接種。第3～6代用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 臍帶MSC的鑒定 ①表型鑒定：第4代MSC，吸去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，用2.5 g/L胰酶消化下來，300×g離心5 min，棄上清，用PBS重懸并計(jì)數(shù)。每管細(xì)胞約106個(gè)，用100 μL PBS重懸，分別標(biāo)記 anti-human CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD166、CD44等抗體，渦旋，4 ℃孵育30 min，后每管加2 mL PBS洗兩遍，洗去未結(jié)合的抗體，最后用250 μL PBS重懸，渦旋后上機(jī)進(jìn)行流式檢測。②成骨誘導(dǎo)分化：將第4代臍帶MSC接種于6孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)到90%，吸掉舊培養(yǎng)，加入成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，每3 d換液，誘導(dǎo)14 d后用茜紅素染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。③成脂誘導(dǎo)分化：同上，加入成脂誘導(dǎo)A液，誘導(dǎo)3 d后換液加入成脂誘導(dǎo)B液誘導(dǎo)1 d，反復(fù)7個(gè)循環(huán)后，進(jìn)行油紅染紅觀察脂滴形成情況。

1.3 建立小鼠急性肺損傷（ALI）模型

參考 Danchuk［11］和 Mei［12］的方法，采用 LPS 滴鼻法進(jìn)行ALI造模。具體為：采用氯胺酮/甲苯噻嗪（Ketamin/Xylazine）混合麻醉劑90/7.5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，將麻醉好的小鼠以上面兩顆門牙為勾懸掛于4號線上，將小鼠舌頭輕輕向一側(cè)拉出，保持氣道開放。根據(jù)體質(zhì)量滴入相應(yīng)的LPS（5 mg/kg）或等量的PBS。滴完后靜止3～5 min，觀察呼吸無異常后，將小鼠置于雙手掌心，左右翻轉(zhuǎn)使滴入液體在小鼠肺內(nèi)分布均勻。

1.4 肺組織病理評分

取完整肺組織用40 g/L多聚甲醛固定，固定后取左肺葉行病理切片和蘇木素-伊紅（hematoxylineosin staining，HE）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理改變，并進(jìn)行肺損傷評分［13］。在光學(xué)顯微鏡下，每張片隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野，對以下4個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行評分：①肺泡充血，②出血，③肺泡和肺間質(zhì)炎癥（肺間隙中性粒細(xì)胞集聚或浸潤），④肺水腫程度（肺泡壁增厚或透明膜形成）。評分標(biāo)準(zhǔn)0分：最輕微損害，1分：輕度損害，2分：中度損害，3分：重度損害，4分：最嚴(yán)重?fù)p害，總分相加即為病理評分。

1.5 肺泡灌洗液的獲取

經(jīng)尾靜脈注射MSC及PBS后48 h，采用10%水合氯醛深度麻醉小鼠，取仰臥位并固定四肢，使用動靜脈置管進(jìn)行氣管穿刺，用1 mL注射器連接動靜脈置管口，每次1 mL PBS，反復(fù)灌洗3次，回收的液體即為肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。300×g，5 min離心后上清凍于-80 ℃度冰箱進(jìn)行ELISA檢測，離心得到的細(xì)胞，若紅細(xì)胞較多可裂紅，裂紅后用PBS重懸計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完后，剩下的細(xì)胞離心，用于流式檢測及提取RNA。

1.6 肺泡灌洗液細(xì)胞和MH-S細(xì)胞流式檢測

分別從體內(nèi)及體外獲得肺泡灌洗液細(xì)胞和MH-S細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞總數(shù)在（0.5～1）×106個(gè)細(xì)胞之間。將細(xì)胞重懸在100 μL PBS中，分別標(biāo)記 anti-mouse F4/80 APC、CD86 PE、CD206 FITC流式抗體，方法同上MSC流式檢測。

1.7 熒光定量PCR（qPCR）檢測巨噬細(xì)胞CD86、TNF-α、CD206、IL-10、Arg-1的mRNA表達(dá)水平

根據(jù)Trizol使用說明書提取細(xì)胞總RNA，測濃度，取1 μg RNA用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行熒光定量PCR時(shí)，以GAPDH作為內(nèi)參。采用SYBR Green Master（Rox）（Roche）在羅氏 LightCycler96儀器上完成操作。實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列如表1所示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 用于定量RT-PCR的基因名稱和引物序列Table 1 Gene names and primer sequence used for quantitative RT-PCR

1.8 ELISA檢測

小鼠肺泡灌洗液300×g，5 min離心后得到上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，檢測小鼠TNF-α因子的濃度，每組重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20軟件分析數(shù)據(jù)，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)采用ANOVA分析或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，以Bonferroni法檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)間多重比較；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 臍帶MSC的形態(tài)、成骨和成脂分化能力鑒定及表面標(biāo)記鑒定Fig.1 Identification of morphological，osteogenic and adipogenic differentiation capacity and surface markers of umbilical cord MSC

2 結(jié)果

2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、成骨成脂分化能力鑒定及表型鑒定

MSC細(xì)胞呈貼壁生長，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈長梭形，平行排列或旋渦狀（圖1A）。第4代MSC成骨誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行茜素紅染色，可見細(xì)胞爬片上出現(xiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)（圖1B）；成脂誘導(dǎo)28 d后行油紅染紅可見紅色的脂滴（圖1C）。用第4代的MSC進(jìn)行表面markers標(biāo)記，流式結(jié)果顯示為CD29、CD90、CD73、CD105、CD166、CD44呈強(qiáng)陽性表達(dá)，CD45、CD34呈陰性表達(dá)（圖1D）。

2.2 MSC在體外誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系（MH-S細(xì)胞）向M2型極化，該作用可以被PGE2抑制劑能逆轉(zhuǎn)

將巨噬細(xì)胞和MSC共培養(yǎng)后，檢測M2型巨噬細(xì)胞marker CD206、IL-10、Arg1。發(fā)現(xiàn)MSC可以誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞向M2型極化，LPS+MSC組（n=3）CD206陽性細(xì)胞的比例較LPS組（n=3）明顯升高（圖2A；19.7%±0.6%vs 11.4%±0.7%，t=8.936，P ＜0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）。在mRNA水平上，LPS+MSC組IL-10和Arg1水平也較LPS組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2，圖2C、D）。我們在MSC和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入了MSC可溶性因子的抑制劑，發(fā)現(xiàn)加入PGE2 inhibitor（n=3）時(shí)CD206陽性細(xì)胞比例明顯低于LPS+MSC組（n=3；8.4%±0.9%vs 18.5%±1.4%，t=6.137，P＜0.01）。加入TGF-β抑制劑、IDO抑制劑，CD206陽性細(xì)胞比例差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2E）。

圖2 MSC在體外誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞向M2型極化，前列腺素E 2抑制劑能逆轉(zhuǎn)該作用Fig.2 MSC induce MH-S cells to polarize to M2 phenotype in vitroand prostaglandin E2 inhibitor can reverse the effect

2.3 MSC有效改善小鼠ALI模型

接下來，我們利用LPS成功誘導(dǎo)了急性肺損傷模型；光鏡下觀察可見control組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，病理評分低；ALI組有較多肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡破裂、融合，肺泡有較明顯的充血及出血，間質(zhì)增寬，肺泡腔及間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺組織病理評分高；ALI+MSC組肺損傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少（圖3A）。ALI組病理評分較高，ALI+MSC組（n=5）病理評分較ALI組（n=5）明顯降低（4.2±0.4 vs 13.4±0.5，t=14.55，P ＜ 0.001；圖3B）。

表2MH-S細(xì)胞的IL-10和Arg1 mRNA相對表達(dá)水平Table 2 Relative expression levels of IL-10 and Arg1 mRNA in MH-S cells

2.4 MSC治療急性肺損傷模型伴隨巨噬細(xì)胞向M2型極化

進(jìn)一步為了研究MSC在體內(nèi)對肺泡巨噬細(xì)胞的影響，通過對肺泡灌洗液流式檢測發(fā)現(xiàn)，ALI+MSC組（n=3）CD206陽性細(xì)胞比例明顯高于ALI組（n=3；37.6%±1.4%vs 8.5%±0.4%，t=20.09，P＜0.001；圖4A、B），ALI+MSC組（n=3）中INOS陽性細(xì)胞比例較ALI組（n=3）明顯降低（5.90%±0.16%vs 40.27%±5.87%，t′=5.86，P=0.028；圖4C、D）。肺泡灌洗液細(xì)胞中的TNF-α和CD86的mRNA表達(dá)水平較ALI組明顯降低，CD206和IL-10的mRNA表達(dá)水平ALI+MSC組較ALI組明顯升高（表3，圖4E）。ELISA結(jié)果顯示ALI組（n=3）TNF-α明顯升高，ALI+MSC組（n=3）TNF-α濃度明顯降低（412.3±6.5 vs 527.4±5.6，t=13.4，P ＜0.001；圖4F）。

圖3 MSC對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷病理學(xué)改變的影響Fig.3 The effects of MSC on histopathological changes in LPS-induced ALI in mouse

3 討論

急性肺損傷發(fā)病誘因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制不明確，缺乏有效的治療手段。在急性肺損傷病程中，肺泡巨噬細(xì)胞可以抵御呼吸道病原體，并在遠(yuǎn)端支氣管及肺泡中參與炎癥反應(yīng)［14］，是主要的效應(yīng)細(xì)胞［15］。但因其根據(jù)所處微環(huán)境的改變具有向不同表型極化的特性，使其在急性肺損傷病程中成為一把雙刃劍［16］。

表3BALF中細(xì)胞CD86、TNF-α、CD206和IL-10 mRNA相對表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of CD86，TNF-α，CD206 and IL-10 mRNA in BALF cells

表3BALF中細(xì)胞CD86、TNF-α、CD206和IL-10 mRNA相對表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of CD86，TNF-α，CD206 and IL-10 mRNA in BALF cells

ALI：acute lung injury；MSC：mesenchymal stem cell.

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已有研究證實(shí)，輸注MSC治療后可以減少促炎因子的產(chǎn)生，并能與巨噬細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10［16］。并且MSC可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及殺菌功能［14］，但是MSC與巨噬細(xì)胞之間的相互作用目前并不明確。我們用MSC在體外和小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系（MH-S細(xì)胞）隔離共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)MSC可以誘導(dǎo)CD206陽性的細(xì)胞增多，并且IL-10的表達(dá)水平也比LPS刺激組明顯增加。說明MSC發(fā)揮作用并不通過與巨噬細(xì)胞直接接觸，而是通過旁分泌途徑。許多研究已經(jīng)證明MSC可以分泌多種可溶性因子，PGE2是其中的一種強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)作用的因子。有文獻(xiàn)報(bào)道，創(chuàng)傷時(shí)，PGE2能促進(jìn)傷口處的巨噬細(xì)胞向M2極化從而促進(jìn)傷口的修復(fù)［17］，也有研究指出在小鼠過敏氣道炎癥模型中，當(dāng)血液中PGE2濃度升高時(shí)，肺中的巨噬細(xì)胞向M2極化增多，并且這種增多可以被PGE2的抑制劑阻止。我們在MH-S和MSC共培養(yǎng)培養(yǎng)體系中加入PGE2、TGF-β、IDO的抑制劑，發(fā)現(xiàn)只有PGE2抑制劑可以明顯逆轉(zhuǎn)MSC對M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)。有研究證明PGE2部分通過激活cAMP途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞向M2極化，但潛在的機(jī)制尚不清，是否還通過其他途徑來誘導(dǎo)M2極化，仍需我們進(jìn)一步深入研究。

在本研究中，我們成功建立了小鼠急性肺損傷模型，輸注臍帶MSC后的確能緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷癥狀。MSC治療組肺泡巨噬細(xì)胞CD206陽性的細(xì)胞比例明顯升高，并且IL-10和Arg1的表達(dá)也是明顯升高的。我們從體內(nèi)體外均證明MSC能抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)抑炎因子的產(chǎn)生，在體外可以通過旁分泌途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。并且MSC發(fā)揮這種治療作用是通過PGE2途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化途徑，但巨噬細(xì)胞發(fā)生這種表型改變的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。由此可以為MSC用于臨床治療ALI提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

圖4 MSC能誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中的M2型巨噬細(xì)胞增多Fig.4 MSC can induce M2 macrophage increase in bronchoalveolar lavage fluid of mice with ALI