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    應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定死活結(jié)核分枝桿菌的實驗研究

    2019-05-30 06:36:22王偉亮孟繁榮劉志輝譚守勇張言斌
    關(guān)鍵詞:活菌菌液個數(shù)

    王偉亮,謝 貝,孟繁榮,王 楠,楊 瑜,劉志輝,譚守勇,張言斌

    (1.廣州醫(yī)科大學(xué),廣東廣州511436;廣州市胸科醫(yī)院2.結(jié)核內(nèi)科,3.肺部疾病研究所,廣東廣州510095)

    據(jù)WHO估計,2017年全球有約1 000萬例結(jié)核病患者,其中利福平耐病例約56萬、耐多藥結(jié)核病例約46萬,結(jié)核病為目前單因致死率最高的十大感染性疾病之一(其于HIV/AIDS),是全球的重大公共衛(wèi)生問題[1]。利福平耐藥病例和耐多藥結(jié)核病例的流行與蔓延[2]對實現(xiàn)WHO提出的2035年全球終結(jié)結(jié)核病的宏偉目標(biāo)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[3]。挑戰(zhàn)主要來自兩個方面:一是沒有較為理想的早期診斷方法[4],二是沒有較多可供選擇的抗結(jié)核新藥[5]。就早期診斷而言,目前主要依據(jù)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗和耐藥基因分子檢測[4,6]:前者耗時長,平均約需2個月;后者雖然快速,但技術(shù)要求較高、檢測費(fèi)用昂貴,且存在檢測的準(zhǔn)確性問題。另外,在同一樣本中同時存在耐藥菌與敏感菌的結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥更使結(jié)核分枝桿菌耐藥性的準(zhǔn)確鑒定困難加?。?],高旭等[8]應(yīng)用用基因測序和熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的相關(guān)研究顯示,它們不能指示耐藥菌比例低于20%的混合菌液。我們設(shè)想,若有一種方法能定量指示樣本中的耐藥菌與敏感菌,結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性和異質(zhì)性耐藥的測定則可同時得到解決。此前,人們就對流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)在此類問題中的應(yīng)用進(jìn)行了諸多探索[9-10],并已取得了全面的進(jìn)步與輝煌的成就[11],其間也偶有利用FCM進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性測定的實驗研究報道[12]。判斷細(xì)菌對某種抗生素是否耐藥的核心標(biāo)志是一定條件下接觸藥物后能否存活,若人們可以找到能良好標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌活菌與死菌的熒光染料,而FCM能進(jìn)行單細(xì)胞計數(shù)分析,兩者相結(jié)合則可對樣本中的死、活菌(亦即敏感菌和耐藥菌)進(jìn)行定量分析。前期研究中,我們探討了6-羧基二乙酰熒光素(6-Carboxyfluorescein diacetae,6-cFDA)、熒光素雙醋酸酯(fluorescein diacetae,F(xiàn)DA)、碘化丙錠(Propidium Iodide,PI)和SYTO9等染料對結(jié)核分枝桿菌的染色性能[13],本研究在此基礎(chǔ)上選擇了PI和6-cFDA兩種染料用于死、活結(jié)核分枝桿菌的鑒定,并對其鑒定能力進(jìn)行了系統(tǒng)的確證性實驗研究,報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗菌株

    在本院結(jié)核病生物樣本庫中隨機(jī)抽取-80℃凍存結(jié)核分枝桿菌臨床分離株60株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng);選擇復(fù)蘇培養(yǎng)生長良好的20株隨機(jī)均分兩組,按后續(xù)實驗需求進(jìn)行增菌培養(yǎng)。另外,從凍存庫中取出結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)與增菌培養(yǎng),用于FCM分析方法建立,實驗操作與臨床分離株相同,具體操作見實驗方法。研究所用結(jié)核分枝桿菌活菌菌液為新鮮培養(yǎng)且生長良好的對數(shù)期鮮活菌液;死菌菌液制備依據(jù)參考文獻(xiàn)[14]將1麥?zhǔn)蠞岫然罹航?jīng)85℃加熱30 min處理而得,并經(jīng)Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)8周證實無細(xì)菌生長。實驗工作經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 儀器與試劑

    流式細(xì)胞儀FACSAriaTMⅡ為美國BD公司生產(chǎn),細(xì)菌超聲分散儀BACspreaderTM 1100為廣東體必康生物科技有限公司生產(chǎn);300目不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)購自翔博生物科技有限公司,Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基和Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基購自美國BD公司,PI購自美國LIFE公司,6-cFDA購自美國SIGMA公司,PBS(pH 7.4±0.1)購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 復(fù)蘇培養(yǎng) 考慮到-80℃凍存菌株僅約60%的復(fù)蘇成功率,在生物樣本庫中應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)挑選3倍于研究樣本量的60株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。主要實驗步驟包括:取出凍存菌株37℃恒溫箱放置約24 h,取約0.3 mL凍存菌株混懸液接種于Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基斜面,置37℃恒溫箱培養(yǎng)4周。

    1.3.2 增菌培養(yǎng) 在60株復(fù)蘇培養(yǎng)樣本中挑選生長良好菌株20株,隨機(jī)分為兩組,一組用于平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)界值確定試驗,一組用于性能檢測試驗。主要實驗步驟包括:在復(fù)蘇培養(yǎng)管中挑取菌落置于約4 mL Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中,應(yīng)用細(xì)菌超聲分散儀制作1麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌混懸液,取約0.3 mL混懸液接種于Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基斜面,每一菌株接種2~3管,置37℃恒溫箱培養(yǎng)4周。

    1.3.3 PI、6-cFDA熒光染料貯存液配制 PI為1 mg/mL成品溶液,無須配制,置4℃冰箱避光保存。6-cFDA貯存液配制:稱取6-cFDA 9.2 mg,加入20 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解,待粉末徹底溶解后用孔徑為0.25 μm的一次性針頭式濾器過濾,配制成1 mmol/L的6-cFDA溶液,分裝至EP管中(約130 μL/支)-20℃冰箱避光保存。

    1.3.4 FCM分析菌液樣本制備 取增菌培養(yǎng)生長良好的標(biāo)準(zhǔn)菌株、MFI界值確定試驗菌株和性能檢測試驗菌株菌落,用無菌玻璃棒蘸取無菌生理鹽水將菌研磨成菌液勻漿,加入適量無菌生理鹽水混勻,再用細(xì)菌超聲分散儀分散,經(jīng)300目不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)濾過后,用無菌生理鹽水配制2管(2 mL/管)1麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌混懸液,并將其中1管放至恒溫水浴箱中85℃加熱30 min。加熱者即為死菌分析懸液,未加熱者則為活菌分析懸液。另外,對死菌分析懸液加做Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)實驗,實驗方法同上述增菌培養(yǎng)。

    1.3.5 分析菌液PI與6-cFDA染色 臨用前,取出PI、6-cFDA貯存液,在避光情況下解凍并應(yīng)用PBS分別進(jìn)行200、50倍稀釋配制PI(5 μg/mL)和6-cFDA(20 μmol/L)工作液;在樣品管中加入300 μL分析菌液,再向其中加入300 μL PI或6-cFDA工作液,充分震蕩混勻,37℃恒溫孵育30 min,即為流式細(xì)胞儀檢測分析液。

    1.3.6 流式細(xì)胞儀分析方法的建立與目的樣本檢測分析 首先,用熒光微球校準(zhǔn)儀器的光路和液流系統(tǒng),保證儀器各項指標(biāo)在允許范圍。其次,以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv檢測分析液建立FCM分析方法,F(xiàn)CM分析方法建立的主要原則如下:以生理鹽水管和活菌管設(shè)前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)的信號值為對數(shù)放大,根據(jù)FSC/SSC的信號情況調(diào)節(jié)電壓;根據(jù) FSC(log)、SSC(log)、FITC(log)、PE(log)等參數(shù),找到細(xì)菌最集中的區(qū)域設(shè)門,同時建立直方圖以計算PE、FITC通道上MFI,活菌管和死菌管互為對照。最后,依據(jù)建立的FCM分析方法分析目的樣本。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,正態(tài)分布計量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布計量結(jié)果用中位數(shù)表示,正態(tài)性檢驗應(yīng)用Shapiro-Wilk方法;活菌組與死菌組組間比較采用兩個獨立樣本的t檢驗(正態(tài)分布時)或兩個獨立樣本的秩和檢驗(非正態(tài)分布時),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)確定 MFI界值;性能檢測中的準(zhǔn)確度描述采用分類變量計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。準(zhǔn)確度=(真陽性個數(shù)+真陰性個數(shù))/總數(shù),靈敏度=真陽性個數(shù)/(真陽性個數(shù)+假陰性個數(shù)),特異度=真陰性個數(shù)/(真陰性個數(shù)+假陽性個數(shù)),Youden指數(shù)=靈敏度+特異度-1,陽性預(yù)測值=真陽性個數(shù)/(真陽性個數(shù)+假陽性個數(shù)),陰性預(yù)測值=真陰性個數(shù)/(真陰性個數(shù)+假陰性個數(shù))。

    2 結(jié)果

    2.1 FCM分析方法的建立

    以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv建立FCM分析方法:應(yīng)用活菌FCM分析菌液設(shè)門如圖1A;應(yīng)用無菌生理鹽水空白對照進(jìn)行檢測,其FSC/SSC二維散點圖見圖1B;應(yīng)用死、活菌PI染色后的分析菌液進(jìn)行FCM分析得PE通道的直方圖1C和D;應(yīng)用死、活菌6-cFDA染色后的分析菌液進(jìn)行FCM分析得FITC通道的直方圖1E和F。圖1B表明設(shè)門適當(dāng),圖1C、D表明PI染色能準(zhǔn)確鑒定H37Rv死菌,圖1E、F表明6-cFDA染色能準(zhǔn)確鑒定H37Rv活菌。

    圖1 標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv死、活菌經(jīng)PI或6-cFDA染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.1 Flow Cytometry Results of Dead or Living H37Rv Stained with PI or 6-cFDA

    表1 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株P(guān)I或6-cFDA染色的MFI檢測Table 1 Detection of MFI of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis after staining with PI or 6-cFDA

    2.2 PI和6-cFDA染色鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的MFI界值確定

    2.2.1 PI和6-cFDA染色樣本MFI測定情況 10株死、活結(jié)核分枝桿菌PI染色的MFI值分別在1 886~5 967和219~772之間,死菌MFI值呈非正態(tài)性分布(P=0.014)、活菌MFI值呈正態(tài)分布(P=0.383);10株死、活結(jié)核分枝桿菌經(jīng)6-cFDA染色的MFI值分別在43~56和1 986~13 530之間,均呈正態(tài)性分布(表1)。

    2.2.2 死、活結(jié)核分枝桿菌PI和6-cFDA染色樣本間MFI的比較 對于PI染色,死菌MFI值呈非正態(tài)性分布、活菌MFI值呈正態(tài)分布,經(jīng)兩個獨立樣本的秩和檢驗Mann-Whitney U=0.00;Wilcoxon W=55.00;Z=-3.78,雙側(cè)檢驗P=0.000,活、死菌之間PI染色后的MFI差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對于6-cFDA染色,死、活菌MFI值均呈正態(tài)分布,兩樣本所屬總體方差不齊(F=25.635,P=0.000),經(jīng)t′檢驗,t=4.973,P=0.001,活、死菌之間6-cFDA染色后的MFI差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2.2.3 PI和6-cFDA染色鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的ROC曲線與MFI界值 依據(jù)MFI測定值分別繪制應(yīng)用PI和6-cFDA染色鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的ROC曲線,如圖2A和B。由圖可見兩者ROC曲線下的面積均為1.000,標(biāo)準(zhǔn)誤差均為0.000,其95%的近似參考置信區(qū)間均為(1.000,1.000),說明兩種染色方法用于鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確度均較高。綜合靈敏度和特異度,PI染色鑒定死菌和6-cFDA染色鑒定活菌的MFI檢測界值分別為1 329和1 021,此時兩種染料鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的靈敏度均為1、特異度均為1。即當(dāng)結(jié)核分枝桿菌菌液經(jīng)PI染色后的MFI值大于1 329時,認(rèn)為該菌液為死菌;當(dāng)結(jié)核分枝桿菌菌液經(jīng)6-cFDA染色后的MFI值小于1 021時,認(rèn)為該菌液為活菌。綜上,PI染色可以明確鑒定死結(jié)核分枝桿菌、6-cFDA染色能夠明確鑒定活結(jié)核分枝桿菌。

    表2 PI或6-cFDA染色鑒定結(jié)核分枝桿菌臨床分離株死和活Table 2 Identification of dead or living status of clinical isolates Mycobacterium tuberculosis by PI or 6-cFDA staining

    2.3 應(yīng)用MFI界值鑒定死和活結(jié)核分枝桿菌

    應(yīng)用不同于MFI界值確定的10株死、活結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行測試,經(jīng)PI染色10株死菌全部鑒定為死菌、10株活菌中有1株鑒定為死菌(其MFIPI為1 342,MFI6-cFDA為12 867),準(zhǔn)確度為95%;經(jīng)6-cFDA染色10株活菌全部鑒定為活菌、10株死菌全部鑒定為死菌,準(zhǔn)確度為100%(表2),并對兩種染料的鑒定性能進(jìn)行評估(表3)。

    圖2 PI染色鑒定死菌(A)和6-cFDA染色鑒定活菌(B)MFI的ROC曲線分析Fig.2 Analysis of ROC curves of PI staining MFI for dead bacteria detection(A)and 6-cFDA staining MFI for living bacteria detection(B)

    3 討論

    對于細(xì)菌的活力迄今尚無直接測量指標(biāo),目前人們一般應(yīng)用核酸染色、細(xì)胞膜功能試驗、氧化還原反應(yīng)和特定基因報告系統(tǒng)等間接評估細(xì)菌活力。PI作為一種非膜通透性染料,可以被完整的原核和真核細(xì)胞膜排斥于細(xì)胞膜外,只有當(dāng)細(xì)菌活力嚴(yán)重降低或其它原因而致細(xì)胞膜完整性遭到破壞時,PI方能進(jìn)入細(xì)胞以其菲啶環(huán)與細(xì)菌核酸結(jié)合并具增強(qiáng)熒光作用,因此PI染色著色即可顯示細(xì)菌已無活力;6-cFDA則是膜通透性染料,經(jīng)孵化后進(jìn)入活性細(xì)胞被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解形成不能透過細(xì)胞膜的6-羧基熒光素而使細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生熒光,死細(xì)胞則因缺乏活性酯酶而不能有效水解6-cFDA產(chǎn)生熒光[15]。我們的研究結(jié)果表明PI染色能準(zhǔn)確鑒定加熱致死的結(jié)核分枝桿菌死菌、6-cFDA染色可準(zhǔn)確鑒定結(jié)核分枝桿菌活菌,此為人們應(yīng)用FCM檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性與耐藥異質(zhì)性構(gòu)建了基礎(chǔ)性前提。目前我們尚未查見應(yīng)用6-cFDA染色鑒定結(jié)核分枝桿菌死、活的相關(guān)文獻(xiàn),但對于PI染色鑒定結(jié)核分枝桿菌死、活,我們則注意到了羅燕輝等[16]有關(guān)PI不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌死、活菌的研究結(jié)果。本文與其結(jié)果的迥異是否源自PI染色時間的差異(文獻(xiàn)[16]的染色時間為15 min,本研究為30 min)目前不得而知,有待探究。

    從表1我們可以看到:本實驗10例死菌PI染色MFI值的全距為4 081(5 967-1 886)、四分位間距為2 215(4 399-2 184),10例活菌6-cFDA染色MFI值的全距為11 544(13 530-1 986)、標(biāo)準(zhǔn)差為4 512。10例臨床分離株死菌經(jīng)PI染色后其熒光強(qiáng)度差異較大,反映出這10例臨床分離株死菌對PI染料的透過性和結(jié)合力差異較大。10例臨床分離株活菌經(jīng)6-cFDA染色后熒光強(qiáng)度差別較大,反映出各臨床分離株菌株酯酶表達(dá)量或其活力差異較大。這些數(shù)據(jù)充分說明:不同的臨床分離株,無論是經(jīng)非膜透性染料PI染過的死菌還是膜透性染料6-cFDA染過的活菌,其MFI值均具有較大的離散趨勢。盡管如此,活菌PI染色和死菌6-cFDA染色的MFI值較為集中,因此不影響這兩種染料對結(jié)核分枝桿菌死、活狀態(tài)的鑒定。同時,不同臨床分離株活力不同導(dǎo)致的染色后MFI值的差異,也從側(cè)面說明了PI和6-cFDA的MFI值能很好的反應(yīng)菌群中細(xì)菌活力的平均水平,具有進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的潛力。為了消除臨床分離株之間本身差異對檢測結(jié)果的影響,對檢測數(shù)值進(jìn)行歸一化處理,我們將更關(guān)注同一株臨床分離株經(jīng)藥物處理前后MFI值的比值,而非其MFI值本身。

    表3 PI或6-cFDA染色鑒定結(jié)核分枝桿菌臨床分離株死、活的診斷性能Table 3 Diagnostic performance of PI or 6-cFDA staining for identification of dead or living clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis

    另外,我們在應(yīng)用MFI界值鑒定死、活結(jié)核分枝桿菌的性能驗證實驗中發(fā)現(xiàn):表2中的4號活菌經(jīng)PI染色后MFIPI=1 342,此值略高于PI染色判斷為死菌的界值(1 329),依據(jù)PI染色單個指標(biāo)來看該樣本應(yīng)判定為死菌;但樣本的制備過程及6-cFDA染色檢測結(jié)果指示受檢菌為活菌。為何如此?我們目前認(rèn)為原因可能只有一個:該活菌菌液中既存在大量活菌又存在低比例的死菌,其低比例死菌的存在導(dǎo)致了PI染色的假陽性,但目前還沒有很好的實驗可以證實死、活菌的混合性存在,我們所開展的包括本實驗在內(nèi)的系列研究即旨在解決菌液中細(xì)菌活力異質(zhì)性檢測問題(此為細(xì)菌異質(zhì)性耐藥檢測方法學(xué)中的關(guān)鍵技術(shù)問題)。這就提示我們:為最大限度消除受檢細(xì)菌生命活力非均一性的影響,應(yīng)用FCM檢測細(xì)菌死、活宜以采用雙染料染色為妥。尤其是在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測及異質(zhì)性耐藥檢測中我們必須慮及:抗結(jié)核藥物作用下的結(jié)核分枝桿菌的活力狀況可能遠(yuǎn)非加熱處死結(jié)核分枝桿菌之死、活截然分開的狀況。不同臨床分離株因其本身活力的差異,會存在藥物敏感性方面的差異,因此,同樣條件的藥物處理后不同的臨床分離株會有不同比例的菌處于復(fù)雜的死、活菌中間態(tài)。這就使應(yīng)用FCM進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測尤其是結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥檢測呈現(xiàn)諸多困難,同時也許是近些年來此方面研究不多而相應(yīng)技術(shù)止步不前的重要原因之一。但是FCM檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的方法相對于表型檢測法快速[17],相對于基因型檢測法準(zhǔn)確,更具有定量檢測結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的潛力,正是這些優(yōu)勢敦促我們迎難而行。如何克服檢測樣本中細(xì)菌藥物敏感性差異帶來的非均一化問題將成為我們后續(xù)研究的難點,我們當(dāng)努力為之。

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