ER stress及PUMA對5-FU誘導的肝臟細胞損傷與凋亡的影響

劉 珊，李嘯峰，譚嗣偉，劉慧玲，吳 斌

（中山大學1.附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 珠海，519000；2.附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510630）

5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是腸癌標準化療的基礎(chǔ)藥物，主要通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶進而抑制DNA的合成發(fā)揮抗腫瘤作用［1］，然而在治療同時5-FU及其代謝產(chǎn)物會對肝臟產(chǎn)生毒性作用，誘導肝臟細胞的損傷及凋亡［2］。Bcl-2家族包括一系列對細胞凋亡的進程起到調(diào)控作用的蛋白，p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）屬于其BH3-only亞家族，是促進細胞凋亡的關(guān)鍵分子。PUMA能將凋亡信號傳遞至線粒體并刺激Bax和Bak蛋白易位，進而引起細胞色素c的釋放導致Caspase家族蛋白活化，最終引起細胞凋亡［3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及折疊場所，具有調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激反應(yīng)的功能。多種生理及病理狀態(tài)會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)的大量堆積，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［4］。此時細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯過程發(fā)生改變，加速未折疊或錯誤折疊蛋白的降解，維持細胞的正常功能，此種適應(yīng)性反應(yīng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），熱休克蛋白GRP78表達升高是其激活的標志［5］。UPR可以促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白的降解，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，當過度的損傷超過了UPR的代償能力，細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定將無法維持，此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會激活線粒體凋亡通路，誘導損傷細胞凋亡［6］。本課題組前期研究證實：門脈高壓性胃病通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)PUMA的表達，進而促進了胃粘膜上皮細胞的損傷和凋亡［7］。然而，PUMA和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）是否參與5-FU誘導的肝臟細胞的損傷與凋亡，以及兩者的關(guān)系尚未明確，本研究旨在探討5-FU是否通過激活ER stress-PUMA通路進而誘導的肝臟細胞的損傷與凋亡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）C57/BL6 PUMA+/+（Wild-Type）小鼠 40只，PUMA-/-（Knockout）小鼠 20 只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由 C57/BL6 PUMA-/+小鼠（購自美國杰克森實驗室）繁育所得。所有小鼠飼養(yǎng)于中山大學附屬第三醫(yī)院實驗動物中心［2017（粵）-0083］，保持室溫25℃，光暗周期12 h/12 h，飼養(yǎng)期間小鼠自由進食飲水。實驗工作經(jīng)院倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 主要試劑及抗體 5-氟尿嘧啶（5-FU，Sigma，US），4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA，Sigma，US），蘇木素-伊紅染料（中杉金橋，北京），TUNEL試劑盒（Roche，Switzerland），ALT試劑盒（Cusabio，武漢），AST試劑盒（Cusabio，武漢），Cleaved caspase-3抗體（Cell Signaling Technology，US），GRP78抗體（Abcam，US），PUMA抗體（Abcam，US），β-actin抗體（Abcam，US），DAB顯色液（DAKO，Denmark），Trizol（Thermo Scientific，US），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，上海）

1.2.2 主要儀器 熒光倒置顯微鏡（Leica，Germany），低溫高速冷凍離心機（Eppendorf，Germany），酶標儀（Labnet，US），垂直電泳槽（BIO-RAD，US），轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD，US），PCR 儀（Labnet，US），微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，US），RTPCR儀（BIO-RAD，US）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立5-FU誘導的小鼠肝臟損傷模型 將PUMA+/+小鼠隨機分為4組，PUMA-/-小鼠隨機分為2組，每組10只，共6組：WT正常對照組，WT 4-PBA處理組（WT 4-PBA組），WT 5-FU處理組（WT 5-FU組），WT 5-FU及4-PBA處理組（WT 5-FU＋4-PBA組），KO正常對照組，KO 5-FU處理組（KO 5-FU組）。模型組小鼠給予腹腔注射5-FU 75 mg/kg（正常對照組腹腔注射等量的生理鹽水）［8］，抑制劑組小鼠同時給予腹腔注射4-PBA 150 mg/kg［9］，連續(xù)給藥7 d。

1.3.2 標本采集和處理 在第7天給藥8 h后予以小鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮及甲苯噻嗪混合麻醉［10］，麻醉后眼球內(nèi)眥靜脈叢采血，再行開腹手術(shù)，迅速分離并采取肝組織，部分放入40 g/L多聚甲醛中固定用于制作石蠟標本，部分保存于液氮中，待提取RNA和蛋白質(zhì)。血漿于室溫下靜置1 h后，以1 000 r/min（r=10 cm）的速度離心3 min，結(jié)束后吸取上層血清保存于-80℃冰箱。

1.3.3 蘇木素-伊紅染色（H&E staining） 將制備好的蠟塊預(yù)冷后進行切片，經(jīng)過脫蠟和梯度水化之后，滴加蘇木素液染核2 min，蒸餾水沖洗，于PBST中返藍，之后用伊紅染色30 s左右，蒸餾水沖洗后在顯微鏡下觀察染色效果，后用中性樹膠封片。

1.3.4 免疫組化染色（immunohistochemical staining，IHC staining） 將制備好的蠟塊預(yù)冷后進行切片，經(jīng)過脫蠟和梯度水化之后，室溫下置于3%H2O2中作用10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶；在高溫高壓條件下，將玻片放入pH為6.0的檸檬酸鈉緩沖液中熱修復(fù)抗原2 min；待溫度降至室溫后取出玻片，于室溫下血清封閉10 min；分別滴加一抗：抗-GRP78（1∶200），抗-PUMA（1∶200），抗-Cleaved caspase-3（1∶100），4℃孵育過夜；PBST沖洗5 min后滴加二抗（1∶300），37℃孵育2 h；PBST沖洗后滴加DAB顯色，于蒸餾水中終止反應(yīng)；蘇木素液染核并用中性樹膠封片。顯微鏡下進行觀察拍照及結(jié)果分析：隨機選取20個視野，采用Image J圖像分析軟件進行結(jié)果分析。

1.3.5 TUNEL檢測及凋亡指數(shù)計算 根據(jù)Roche公司的TUNEL產(chǎn)品說明書進行操作，檢測凋亡細胞，DAB顯色后細胞核呈棕褐色為陽性反應(yīng)。每張切片隨機選取20個視野，計算陽性細胞數(shù)和肝細胞總數(shù)，凋亡指數(shù)＝陽性細胞數(shù)/肝細胞總數(shù)×100%。

1.3.6 肝臟組織RNA的提取和實時熒光定量PCR 根據(jù)Trizol試劑說明書按步驟提取肝臟組織總RNA，于分光光度計下測定所提取RNA濃度及純度，應(yīng)用TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；應(yīng)用SYBR Green法對目的基因GRP78、PUMA及內(nèi)參基因β-actin進行Real-time PCR擴增。

1.3.7 肝臟組織總蛋白提取及蛋白電泳 根據(jù)總蛋白提取裂解液說明書按步驟操作，提取肝組織總蛋白并進行定量，保存于-80℃冰箱待用。取適量蛋白樣本進行電泳，應(yīng)用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白印跡轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%牛奶封閉1 h，分別滴加一抗：抗-GRP78（1∶2 000），抗-PUMA（1∶2 000），抗-Cleaved caspase-3（1∶1 500），抗-β-actin（1∶3 000），4℃孵育過夜；TBST洗滌10 min，滴加二抗（1∶2 000）孵育2 h，TBST洗滌10 min，于暗房中曝光。應(yīng)用掃描儀將膠片條帶掃描并轉(zhuǎn)換成灰度模式，應(yīng)用Image J圖像分析軟件進行灰度分析。

1.4 觀察指標等

HE及TUNEL染色評估肝臟病理損傷程度；ELISA法檢測血清中ALT及AST表達水平；免疫組化染色、RT-PCR、蛋白免疫印跡法檢測肝臟組織中PUMA及GRP78表達水平；觀察上述指標在不同處理組小鼠的變化。

1.5 統(tǒng)計學方法

本研究計量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)～上四分位數(shù)）表示。兩組獨立樣本間的比較，符合正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，若以上條件不滿足則采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗。多組獨立樣本組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，當組間比較有統(tǒng)計學差異時，進一步采用Bonferroni法進行多重比較。所有分析均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 5-FU誘導肝臟損傷和凋亡情況

對WT小鼠肝組織進行H&E染色顯示，對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射性索狀排列，匯管區(qū)未見異常；5-FU組肝臟點狀局灶性壞死，壞死區(qū)伴隨出血以及炎癥細胞浸潤，中央靜脈擴張充血（圖1A）。以上結(jié)果提示，在造模劑量下，5-FU誘導了小鼠肝臟組織的損傷。測定WT小鼠對照組及5-FU組血清中ALT的含量，結(jié)果顯示：5-FU組［160（152～188）］U/L明顯高于對照組［25（19～28）］U/L，兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.78，P ＜0.001；圖1B）。測定AST的含量，結(jié)果與ALT的變化情況一致：5-FU組［178（166～198）］U/L明顯高于對照組［30（27～38）］U/L，兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.78，P ＜ 0.001；圖1C）。此結(jié)果進一步印證了小鼠肝臟組織的損傷情況。

對WT小鼠肝組織進行TUNEL染色顯示，對照組肝臟組織內(nèi)僅可見個別凋亡信號，5-FU組陽性信號明顯多于正常對照組（圖1A）。對TUNEL染色結(jié)果進行統(tǒng)計分析，5-FU組凋亡指數(shù)［25（20～28）］%明顯高于對照組［2.2（1.7～3.7）］%，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.78，P ＜0.001；圖1E）。同時提取肝臟組織行蛋白免疫印跡檢測以及灰度分析，結(jié)果顯示Cleaved Caspase-3變化趨勢與TUNEL染色結(jié)果相一致（圖1D），兩組的灰度比值分別為 0.027（0.022～0.030）及 0.088（0.079～0.103），兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.58，P ＜ 0.001；圖1F）。

圖1 5-FU誘導肝臟細胞損傷和凋亡情況Fig.1 Liver cells injury and apoptosis induced by 5-FU

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PUMA參與5-FU誘導的肝臟損傷和凋亡

對WT小鼠肝臟組織行GRP78以及PUMA免疫組織化學染色及TUNEL染色顯示，5-FU組的陽性信號均明顯多于正常對照組（圖2A）。對每組中的10個組織樣本進行染色的隨機計數(shù)（計數(shù)900個細胞），經(jīng)統(tǒng)計分析后得出：對照組和5-FU組中GRP78陽性信號的比率分別為［3.8（3.0～4.4）］%及［35（29～42）］%，且兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.78，P ＜ 0.001；圖2D）；對照組和5-FU組中PUMA陽性信號的比率分別為［4.0，（3.1～5.8）］%及［32（27～37）］%，且兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.78，P ＜ 0.001；圖2E）；對照組和5-FU組中TUNEL陽性信號的比率（即凋亡指數(shù)）分別為［2.3（1.8～3.5）］%及［21（19～27）］%，且兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.78，P＜0.001；圖2F）。

提取WT小鼠肝臟組織的RNA，行Real time-PCR檢測并進行分析，結(jié)果顯示5-FU組中GRP78和PUMA的mRNA相對水平（分別為4.5±0.8及4.7±0.5）較正常對照組（分別為1.0±0.5及1.0±0.4）明顯增加，組間的差異均具有統(tǒng)計學意義（tGRP78=11.7320，PGRP78＜0.001；tPUMA=18.2730，PPUMA＜0.001）（圖2B，C）。

以上證據(jù)表明在5-FU誘導肝臟損傷過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的啟動分子GRP78以及PUMA表達量均升高，提示其參與了肝臟細胞的損傷與凋亡過程。

2.3 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕了5-FU誘導的肝臟損傷和凋亡

為進一步確定GRP78及PUMA與小鼠肝臟損傷及凋亡的關(guān)系，在使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA后，對WT小鼠肝臟組織行GRP78以及PUMA免疫組織化學染色及TUNEL染色可見，這三種指標的變化趨勢具有一致性，正常對照組及4-PBA組小鼠的肝臟組織內(nèi)幾乎無陽性信號，而5-FU組肝臟組織內(nèi)陽性信號明顯增多，5-FU＋4-PBA組可見散在陽性信號（圖3A）。對每組中的10個組織樣本進行TUNEL染色的隨機計數(shù)（計數(shù)900個細胞），經(jīng)統(tǒng)計分析后得出：正常對照組、4-PBA組、5-FU組及5-FU＋4-PBA組的凋亡指數(shù)分別為［2.6（1.5～2.7）］%、［2.6（1.4～3.3）］%、［25（23～30）］%及［12（11～13）］%，5-FU組及5-FU＋4-PBA組間凋亡指數(shù)的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=32.99，Z=3.78，P ＜ 0.001，圖3C）。

提取小鼠肝臟組織蛋白，進行蛋白免疫印跡檢測，結(jié)果顯示正常對照組及4-PBA組小鼠的肝臟組織PUMA及Cleaved caspase-3蛋白的表達較低，而5-FU組這兩種蛋白的表達量明顯增加，5-FU＋4-PBA組表達量較5-FU組明顯下降（圖3B）。對上述條帶進行灰度分析可得，正常對照組、4-PBA組、5-FU組及5-FU＋4-PBA組小鼠肝臟組織PUMA的灰度比值分別為0.093（0.064～0.106）、0.073（0.048～0.108）、0.99（0.76～1.24）及0.40（0.33～0.48），5-FU組及5-FU＋4-PBA組間的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=29.74，Z=3.58，P ＜0.001；圖3D）；上述四組小鼠肝臟組織Cleaved caspase-3的灰度比值分別為0.120（0.108～0.130）、0.110（0.096～0.121）、0.597（0.545～0.704）及 0.230（0.171～0.279），5-FU組及5-FU＋4-PBA 組間的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=32.87，Z=3.78，P ＜0.001；圖3E）。

圖2 小鼠肝臟組織中GRP78及PUMA的表達情況Fig.2 Expression of GRP78 and PUMA in mouse liver tissues

圖3 應(yīng)用ER stress抑制劑后小鼠肝臟組織凋亡情況及GRP78和PUMA的表達情況Fig.3 Liver cells apoptosis and expression of GRP78 and PUMA in mice treated with ER stress inhibitor

以上病理及組織學證據(jù)均表明，在應(yīng)用ER Stress抑制劑4-PBA后，模型組GRP78的表達下調(diào)，PUMA的表達隨之下調(diào)，肝臟細胞凋亡減少，提示GRP78及PUMA在5-FU誘導的肝臟損傷和凋亡中發(fā)揮作用，且該通路中PUMA可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的下游。

2.4 特異性敲除PUMA基因減輕了5-FU誘導的肝臟損傷和凋亡

為了進一步確定PUMA是否參與5-FU誘導的小鼠肝臟細胞損傷和凋亡以及與GRP78作用的關(guān)系，采用PUMA基因敲除小鼠進行驗證。對肝臟組織行HE染色可見，WT及KO正常對照組小鼠的肝臟組織病理結(jié)構(gòu)未見異常，WT 5-FU組小鼠肝臟組織損傷明顯，KO 5-FU組的損傷情況較WT 5-FU組改善（圖4A）。GRP78免疫組織化學染色可見，WT及KO正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)幾乎無陽性信號，WT 5-FU組及KO 5-FU組小鼠肝臟組織陽性信號均增多（圖4A）。Cleaved caspase-3免疫組織化學染色可見，WT及KO正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)幾乎無陽性信號，WT 5-FU組小鼠肝臟組織陽性信號明顯增多，KO 5-FU組可見散在陽性信號（圖4A），對每組中的10個組織樣本進行染色的隨機計數(shù)（計數(shù)900個細胞），經(jīng)統(tǒng)計分析后得出：WT正常對照組，KO正常對照組，WT 5-FU組及KO 5-FU組陽性信號的比率（即凋亡指數(shù)）分別為［2.4（1.6～2.7）］%、［3.3（2.6～3.7）］%、［27（23～28）］%及［12（8.9～14）］%，WT 5-FU組及KO 5-FU組間的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=33.99，Z=3.78，P ＜ 0.001；圖4C）。

提取小鼠肝臟組織蛋白，進行蛋白免疫印跡檢測，結(jié)果顯示W(wǎng)T及KO正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)GRP78表達較低，WT 5-FU組及KO 5-FU組表達量明顯增多（圖4B）且灰度分析顯示這兩組間的差異不具有統(tǒng)計學意義（圖4D）；同時可見，PUMA和Cleaved caspase-3在WT及KO正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)表達極低，在WT 5-FU組明顯升高，然而KO 5-FU組中的表達量較WT 5-FU組明顯下降（圖4B），灰度分析的結(jié)果與觀察結(jié)果一致（圖4E、F）。

以上證據(jù)提示：在相同劑量造模情況下，PUMA敲除會減輕肝臟細胞的損傷和凋亡，PUMA參與了5-FU誘導的肝細胞損傷和凋亡過程；同時得出PUMA的敲除不會影響GRP78的表達，即不會影響ER stress的激活。

圖4 WT及PUMA基因敲除小鼠肝臟組織凋亡情況及GRP78表達情況Fig.4 Liver cells apoptosis and GRP78 expression in WT and PUMA knockout mice

3 討論

本研究中，我們建立了5-FU誘導的小鼠肝臟損傷模型，檢測發(fā)現(xiàn)血清中ALT及AST表達明顯升高，提示小鼠肝臟功能的損傷，TUNEL染色凋亡信號明顯增加且Cleaved caspase-3表達升高進一步表明5-FU誘導了小鼠肝臟細胞的損傷及凋亡。本課題組及其他大量研究結(jié)果證實，在其他系統(tǒng)組織損傷的病理過程中，ER stress可以通過上調(diào)PUMA的表達激活線粒體凋亡途徑，進而促進組織細胞的損傷與凋亡［11-13］，但尚不明確這一過程是否參與了5-FU誘導小鼠肝臟細胞的損傷及凋亡。

PUMA是Bcl-2家族中BH3-only亞家族成員，能夠?qū)⒌蛲鲂盘杺鬟f至線粒體觸發(fā)細胞凋亡，本實驗免疫組化染色以及Real time-PCR檢測均顯示5-FU組小鼠PUMA表達明顯升高，證實PUMA參與了5-FU誘導肝臟細胞損傷和凋亡。同時有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會激活線粒體凋亡通路，誘導損傷細胞凋亡，在本實驗中5-FU組小鼠肝臟組織免疫組化染色以及Real time-PCR檢測顯示伴侶分子GRP78表達明顯升高，提示ER stress也參與了這一損傷及凋亡過程。

為進一步探索PUMA及ER stress參與5-FU誘導的小鼠肝臟細胞損傷及凋亡的途徑，給予小鼠注射ER stress抑制劑4-PBA，結(jié)果顯示同等劑量的5-FU刺激下，4-PBA組小鼠肝臟組織GRP78及PUMA表達低于5-FU組，同時肝臟細胞凋亡明顯減少［14］，證實了PUMA及ER stress參與了5-FU誘導肝臟細胞損傷和凋亡；上述過程中抑制ER stress引起了PUMA的下調(diào)，提示PUMA的表達可能受ER stress的調(diào)控。為驗證以上假說，引入了PUMA基因敲除小鼠，結(jié)果證實等劑量的5-FU誘導時，PUMA基因敲除小鼠的肝臟細胞損傷與凋亡程度較WT小鼠明顯減輕，進一步證實PUMA促進了5-FU誘導的小鼠肝臟細胞損傷及凋亡；同時發(fā)現(xiàn)PUMA的敲除不會影響GRP78的表達，說明PUMA并不參與ER stress的激活過程，結(jié)合上述4-PBA的使用導致5-FU誘導的小鼠肝臟組織中GRP78及PUMA的表達均下調(diào)的結(jié)果，我們有理由認為5-FU誘導的小鼠肝臟損傷過程中，ER stress的激活誘導了PUMA高表達，最終引起了肝臟細胞的損傷及凋亡。

綜上所述，5-FU通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)PUMA的表達，進而促進了肝臟細胞的損傷以及凋亡，提示在PUMA及ER stress是化療性肝損傷的潛在性治療靶點，有希望通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活以及PUMA的表達來減輕以5-FU為代表的化療藥物對肝臟的毒副作用。