人參皂苷Rb1通過(guò)Sirt3/SOD2通路延緩高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老

柯世業(yè)，石光耀，劉定輝，2，吳 琳，溫仁輝，朱潔明，錢孝賢，2

（中山大學(xué)1.附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，2.中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州510630）

糖尿病是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，糖尿病患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病率及病死率是非糖尿病的2.40倍［1］。研究發(fā)現(xiàn)高糖明顯加速血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，而內(nèi)皮細(xì)胞衰老在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等增齡相關(guān)性血管疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［2］。因此，預(yù)防高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老將有望成為防治糖尿病相關(guān)心血管疾病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Sirtuin 3，Sirt3）是NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，其主要位于線粒體內(nèi)，可調(diào)節(jié)大部分線粒體蛋白賴氨酸乙?；?-4］。研究發(fā)現(xiàn)Sirt3能增加超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）活性，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，Sirt3在心血管疾病的防治中發(fā)揮重要作用［5-6］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1能通過(guò)抗氧化應(yīng)激預(yù)防過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）衰老［7-8］。但人參皂苷Rb1對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC衰老的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究旨在從Sirt3/SOD2通路探討人參皂苷Rb1延緩高糖誘導(dǎo)的HUVEC衰老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人參皂苷Rb1購(gòu)自成都普菲德生物科技有限公司，分子式：C54H92O23，分子量：1109.31，為白色粉末狀結(jié)晶，高效液相色譜鑒定純度≥98%；葡萄糖、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（endothelial cell growth supplement，ECGS）購(gòu)自Sigma-Aldrich；Ⅰ型膠原酶、M199培養(yǎng)基和谷氨酰胺購(gòu)自Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自上海吉泰依科賽公司；CCK-8、細(xì)胞裂解液、蛋白定量試劑盒（BCA法）和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天；Annexin V-FITC/PI染色試劑盒和不含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶購(gòu)自南京凱基；3-TYP購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；抗Ⅰ型抗纖溶酶原激活物抑制劑（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）、抗Sirt3、抗SOD2、抗P16和抗GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；Ⅱ抗購(gòu)自武漢博士德；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒和SOD活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成。

1.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)

HUVEC原代分離培養(yǎng)及鑒別參考既往文獻(xiàn)報(bào)道［9-12］，大致過(guò)程如下：取健康無(wú)菌新生兒臍帶，PBS清洗3次，用1g/LⅠ型膠原酶室溫消化15 min，收集的Ⅰ型膠原酶細(xì)胞混合液用1 200 r/min（r=17 cm）離心5 min，棄上清后用預(yù)溫的完全培養(yǎng)基（800 mL/L M199，200 mL/L FBS，20 μg/mL ECGS，1 mmol/L谷氨酰胺）重懸細(xì)胞，吹打混勻后種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。1-2代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

將HUVEC按4×103個(gè)細(xì)胞／孔接種于96孔板中并培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的人參皂苷Rb1（10、20、30、40、50、60和70 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞1 h，再用40 mmol/L葡萄糖刺激24 h。處理結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，用錫箔紙遮蓋后將細(xì)胞置于37℃下孵育1.5 h。最后使用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定各孔的吸光度值。

1.4 SA-β-Gal染色

SA-β-Gal染色參考參考既往文獻(xiàn)報(bào)道［11，13］。大致過(guò)程如下：用PBS輕輕清洗細(xì)胞2次，5 mL/L戊二醛溶液固定5 min后，每孔加入1 mL染色工作液，用錫箔紙遮蓋后將細(xì)胞置于37℃下孵育18 h。孵育結(jié)束后倒置顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)和拍照，SA-β-Gal染色陽(yáng)性率計(jì)算方法為：連續(xù)計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出藍(lán)染細(xì)胞（即SA-β-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞）數(shù)目/400個(gè)細(xì)胞的百分比。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)

用不含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化各實(shí)驗(yàn)組的HUVEC，2 000 r/min（r=17 cm）離心5 min收集細(xì)胞沉淀，PBS輕輕清洗2遍后，加入500 μL試劑盒緩沖液重懸細(xì)胞于流式管中，分別加入Annexin V FITC和PI各5 μL，室溫避光染色15 min后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析染色的細(xì)胞，每個(gè)樣品至少收集104個(gè)細(xì)胞。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕輕沖洗2次，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上充分裂解后用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞蛋白，置于4℃超速離心機(jī)1.2×104r/min（r=8 cm）離心10 min后取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量?？偟鞍字蠓?～10 min，SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用50 g/L脫脂奶粉溶液于室溫封閉1 h，加入PAI-1、P16、Sirt3、SOD2及GAPDH（均為1∶1 000）I抗4°C搖床孵育過(guò)夜。棄去I抗，1×TBST洗5 min／次×3次，加入Ⅱ抗（1∶10 000）于室溫孵育1 h；棄去Ⅱ抗，1×TBST洗5 min/次×3次，用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。最后使用Image J軟件分析圖像。

1.7 MDA含量及SOD2活性的測(cè)定

用PBS輕輕清洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液并用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，于4℃1.2×104r/min（r=8 cm）離心10 min后取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量。分別利用MDA及SOD比色法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HUVEC細(xì)胞蛋白上清液中的MDA含量及SOD2活性水平。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.1 The effects of ginsenoside Rb1 on cell viability

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，呈正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)組間差異性比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），存在差異則采用LSD-t法進(jìn)行組間兩兩比較。選取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度人參皂苷Rb1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

HUVEC接種于96孔板，生長(zhǎng)24 h后，分別給予 10、20、30、40、50、60 和 70 μmol/L 人參皂苷Rb1。24 h后，CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該濃度范圍人參皂苷Rb1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的活性均沒(méi)有影響（圖1A）。然后，我們用該濃度范圍的人參皂苷Rb1預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1 h后，相應(yīng)加入40 mmol/L葡萄糖。培養(yǎng)24 h后，CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組（5 mmol/L葡萄糖處理）相比，高糖組細(xì)胞活性降低，而人參皂苷Rb1具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用，其中40 μmol/L人參皂苷Rb1是最有效的人參皂苷Rb1濃度（圖1B）。所以，后述的實(shí)驗(yàn)就選用40 μmol/L人參皂苷Rb1這一濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。

2.2 人參皂苷Rb1減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老

HUVEC生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，先給予40 μmol/L人參皂苷Rb1共同孵育1 h后，相應(yīng)加入40 mmol/L葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1單獨(dú)干預(yù)對(duì)PAI-1、P16蛋白表達(dá)和SA-β-Gal染色無(wú)顯著影響；高糖組（HG組）細(xì)胞PAI-1、P16蛋白表達(dá)增加，SA-β-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞率增加，與正常對(duì)照組相比具有顯著差異；而40 μmol/L人參皂苷Rb1預(yù)處理能顯著減少高糖誘導(dǎo)的PAI-1、P16蛋白表達(dá)，同時(shí)SA-β-Gal染色結(jié)果也證實(shí)了40 μmol/L人參皂苷Rb1能明顯減少SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目（圖2B、C）。另外，Annexin-V/FITC-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示高糖處理第1-2代HUVEC 24 h，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯差異（圖2A），以排除實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞凋亡效應(yīng)的影響。

圖2 人參皂苷Rb1對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響Fig.2 The effects of ginsenoside Rb1 on high glucose（HG）-induced senescence in HUVEC

2.3 人參皂苷Rb1對(duì)Sirt3和SOD2蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探索人參皂苷Rb1抗高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制，我們對(duì)Sirt3和SOD2的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。Western blot結(jié)果提示40 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的衰老HUVEC內(nèi)Sirt3和SOD2蛋白表達(dá)水平均下降，而人參皂苷Rb1預(yù)處理能部分逆轉(zhuǎn)衰老HUVEC內(nèi)的Sirt3和SOD2蛋白表達(dá)水平的減低（圖3）。

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Sirt3和SOD2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effects of ginsenoside Rb1 on the protein expression of Sirt3 and SOD2 in HUVEC

2.4 人參皂苷Rb1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量和SOD2活性的影響

SOD2表達(dá)減少，直接影響細(xì)胞內(nèi)SOD2活性。與正常對(duì)照組相比，衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中SOD2的活性明顯降低，而人參皂苷Rb1預(yù)處理則部分逆轉(zhuǎn)了SOD2活性的降低，同時(shí)，與正常對(duì)照組相比，衰老細(xì)胞中的MDA含量升高，而人參皂苷Rb1預(yù)處理則部分降低MDA含量（表1）。

2.5 3-TYP顯著抵消人參皂苷Rb1改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用

上述結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt3/SOD2信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的HUVEC衰老。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們通過(guò)使用16 nmol/L Sirt3特異性抑制劑3-TYP與人參皂苷Rb1同時(shí)預(yù)處理HUVEC 1 h后，加入40 mmol/L葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h，通過(guò)western blot檢測(cè)PAI-1和P16衰老蛋白指標(biāo)研究Sirt3在人參皂苷Rb1中的作用。結(jié)果提示HG＋Rb1+3-TYP組Sirt3和SOD2蛋白表達(dá)均較HG+Rb1組明顯降低（圖4A）；且PAI-1和P16蛋白表達(dá)均較HG+Rb1顯著升高（圖4B）。這些結(jié)果說(shuō)明加入Sirt3特異性抑制劑3-TYP后的衰老HUVEC不再受人參皂苷Rb1的保護(hù)。

表1 人參皂苷Rb1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量和SOD2活性的影響Table 1 The effects of ginsenoside Rb1 on MDA content and SOD2 activity in HUVEC

表1 人參皂苷Rb1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量和SOD2活性的影響Table 1 The effects of ginsenoside Rb1 on MDA content and SOD2 activity in HUVEC

1）P ＜0.001vscontrolgroup；2）P＜ 0.001vsHGgroup by LSD-t test after ANOVA.n=3

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3 討論

綜合上述研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)40 mmol/L葡萄糖可誘導(dǎo)原代HUVEC衰老，而40 μmol/L人參皂苷Rb1通過(guò)Sirt3/SOD2信號(hào)通路在一定程度延緩高糖誘導(dǎo)的HUVEC衰老。

我國(guó)糖尿病發(fā)病率約為9.9%，而65～74歲年齡組更是達(dá)到14.1%［14］。血管性疾病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，并是糖尿病其他慢性并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮功能障礙作為血管性疾病進(jìn)程中一個(gè)早期的關(guān)鍵因素，在糖尿病患者中常可出現(xiàn)；長(zhǎng)期的慢性高血糖被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［15］。因此，利用高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的早熟性衰老模型模擬糖尿病患者內(nèi)皮損傷，并探討相應(yīng)機(jī)制，尋求相關(guān)防治方法，能對(duì)糖尿病血管性疾病的未來(lái)防治策略提供更有效的策略。

圖4 抑制Sirt3表達(dá)和人參皂苷Rb1處理對(duì)SOD2蛋白表達(dá)及衰老蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effects of 3-TYP and ginsenoside Rb1 on high glucose（HG）-induced protein expression of SIRT3 andSOD2（A），PAI-1 and P16（B）in HUVEC

Sirt3是一種位于線粒體內(nèi)的去乙?；?，它可指導(dǎo)線粒體能量代謝和氧化應(yīng)激，限制活性氧的積累［16］。由于Sirt3對(duì)維持線粒體功能具有重要作用，而線粒體功能障礙是衰老過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此Sirt3與衰老之間關(guān)系密切［17］。Sirt3的激活與延長(zhǎng)壽命相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Sirt3基因敲除小鼠在第8周出現(xiàn)心肌肥大、纖維化等心臟衰老表現(xiàn)［18］。SOD2是一種特定位于線粒體內(nèi)的SOD，被認(rèn)為是抑制線粒體活性氧的清除酶［19］。研究發(fā)現(xiàn)Sirt3可以通過(guò)上調(diào)線粒體內(nèi)SOD2的表達(dá)，提高SOD2的活性，進(jìn)而提高線粒體清除活性氧能力，抑制衰老及相關(guān)疾病的發(fā)生［20］。

人參是我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)藥材，有很強(qiáng)的抗疲勞、延緩衰老、提高機(jī)體免疫與代謝的功能。人參皂苷Rb1是人參中起藥理作用的主要成分之一［21］。我們既往研究表明，人參皂苷Rb1在心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)中具有保護(hù)作用。過(guò)氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老時(shí)，細(xì)胞活性氧、MDA水平升高，SOD1表達(dá)和活性降低，eNOS表達(dá)和NO含量下降，而人參皂苷可通過(guò)Sirt1去乙?；痚NOS增加NO含量有效地逆轉(zhuǎn)這些改變［8，22］。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，人參皂苷Rb1通過(guò)減輕老年C57BL/6小鼠年齡相關(guān)性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)主動(dòng)脈組織eNOS/NO表達(dá)改善內(nèi)皮功能［23］；人參皂苷Rb1還能通過(guò)mTOR/p70S6K通路改善C57BL/6小鼠腦自然衰老［24］。本研究中發(fā)現(xiàn)，CCK-8結(jié)果表明40 μmol/L人參皂苷Rb1為逆轉(zhuǎn)40 mmol/L葡萄糖損傷的最有效濃度，在加入40 μmol/L人參皂苷Rb1預(yù)處理后，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老能被有效地遏制，SA-β-Gal陽(yáng)性率明顯降低，PAI-1及P16作為內(nèi)皮細(xì)胞衰老特異性蛋白標(biāo)志［25-26］，其表達(dá)減少，Sirt3及SOD2表達(dá)增多，MDA含量降低，SOD2活性升高，而當(dāng)加入16 nmol/L Sirt3特異性抑制劑3-TYP后，人參皂苷Rb1的抗衰老作用消失，說(shuō)明人參皂苷Rb1具有抗高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用，其抗衰老作用可能與人參皂苷Rb1調(diào)控Sirt3/SOD2信號(hào)通路有關(guān)。此研究進(jìn)一步豐富了人參皂苷Rb1抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制。

本研究結(jié)果表明人參皂苷Rb1可通過(guò)激活Sirt3/SOD2信號(hào)通路部分抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC衰老。本課題拓展了我們對(duì)于人參皂苷Rb1抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的認(rèn)識(shí)，但仍需在更多的體內(nèi)研究和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步論證，最終用于糖尿病血管性并發(fā)癥的防治。