基于ROS—MAPK信號通路探討桃葉珊瑚苷抗心肌纖維化作用

羅麗芳 李青 蔡立婧

[摘要] 目的 研究桃葉珊瑚苷（AU）對血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞（CFs）增殖的影響及作用機制。 方法 采用胰酶消化法及差速貼壁法培養(yǎng)大鼠CFs，實驗分為空白對照組、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干預(yù)組、低濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。用CCK8法測定細(xì)胞增殖活性，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定細(xì)胞上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，熒光酶標(biāo)儀檢測活性氧（ROS）水平，Western blot法檢測p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與Ang Ⅱ干預(yù)組比較，中、高濃度AU干預(yù)組CFs增殖和p38MAPK磷酸化被明顯抑制（P < 0.05）。與Ang Ⅱ干預(yù)組比較，低、中、高濃度AU干預(yù)組ROS、Ⅰ、Ⅲ 型膠原的生成明顯減少（P < 0.05）。 結(jié)論 AU可通過ROS-MAPK通路途徑抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原生成。

[關(guān)鍵詞] 桃葉珊瑚苷；心肌成纖維細(xì)胞；增殖；活性氧；p38絲裂原活化蛋白激酶

[中圖分類號] R541.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（b）-0014-04

Anti myocardial fibrosis effects of aucubin based on ROS-MAPK signaling pathway

LUO Lifang LI Qing CAI Lijing

Department of Pharmacy， Jiangxi Provincial People′s Hospital， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of aucubin （AU） on cardiac fibroblasts （CFs） proliferation induced by angiotension Ⅱ （Ang Ⅱ）. Methods Rat CFs were cultured by the methods of trypsin digestion and differential adhesion. They were divided into blank control group， Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） intervention group， low concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （1 μmol/L）]， medium concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （10 μmol/L）]， high concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （100 μmol/L）]. CCK8 method was used to test cell proliferation activity， collagen type Ⅰ， Ⅲ content in cell supernatant were determed by enzyme linked immunosorbent （ELISA）， fluorescence enzyme standard instrument was used to detect reactive oxygen species （ROS） level， Western blot method was used to detect p38MAPK and p-p38MAPK protein expression. Results Compared with Ang Ⅱ intervention group， CFs proliferation and p38MAPK phosphorylation were significantly inhibited in the medium and high concentration AU intervention groups （P < 0.05）. Compared with Ang Ⅱ intervention group， low， medium and high concentration of AU intervention group ROS， the production of collagen type Ⅰ， Ⅲ decreased significantly （P < 0.05）. Conclusion AU can restrain by ROS-MAPK pathway Ang Ⅱ induction of CFs proliferation and collagen formation.

[Key words] Aucubin； Cardiac fibroblasts； Proliferation； ROS； p38MAPK

目前，心血管疾病已嚴(yán)重威脅我國居民健康，由其引發(fā)的死亡率已位居總死因的首位[1-2]。眾多心血管疾病不斷進(jìn)展的共同結(jié)局是心肌纖維化，可使室性心律失常頻發(fā)及血流動力學(xué)異常，最終導(dǎo)致死亡。抑制或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化成為治療多種心臟疾病的最關(guān)鍵的一步[3-4]。桃葉珊瑚苷（aucubin，AU）屬環(huán)烯醚萜苷類化合物，主要存在于忍冬科、車前科、杜仲科植物中，是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[5-7]。研究[8]表明，AU及苷元能清除DPPH自由基、超氧陰離子等自由基，對PCI2細(xì)胞氧化損傷具有保護作用。最新研究[9]發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷可能通過抑制活性氧（ROS）介導(dǎo)的MAPK通路的激活來延緩肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展?；谏鲜鲅芯?，本研究探討AU抗心肌纖維化的作用，并探討其作用機制與ROS-MAPK信號通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生（2 d齡）雄性SD大鼠，體重（8.5±1.2）g，由南昌大學(xué)動物科學(xué)部提供，合格證號：SYXK（贛）2015-0001。飼養(yǎng)條件：新生大鼠和母鼠同放在金屬飼養(yǎng)籠中，室溫（24±1）℃，人工照明12 h/d（7：00～19：00），自由飲食及飲水，新生大鼠由母鼠喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 桃葉珊瑚苷標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：20161123），血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ，美國Sigma公司，批號：A9525），DMEM高糖培養(yǎng)基（凱基生物有限公司，批號：20150318），CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒（全式金，批號：#J20705），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號：20170413），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20170524），小鼠抗p38 MAPK（美國Santa Cruz公司，批號：B1655）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）抗體（美國Santa Cruz公司，批號：B1643），兔抗波形蛋白（Vimentin）抗體（美國Santa Cruz公司，批號：B1607），ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號：S0033），Ⅰ型膠原檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海拜力生物科技公司，批號：20170303）、Ⅲ型膠原檢測ELISA試劑盒（上海拜力生物科技公司，批號：20160224）。

1.1.3 主要儀器 迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠）；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；自動酶標(biāo)儀（Bio Tek Synergy H1）。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）的獲得與培養(yǎng) 將出生2 d的SD大鼠在75%乙醇中浸泡數(shù)秒，對其頸部以下進(jìn)行消毒，開胸取出大鼠心臟，用磷酸鹽緩沖液（含雙抗）清洗3次，并剪碎。依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.06%胰蛋白酶消化5 min，收集上清液，重復(fù)消化2次，收集懸浮液，1000 r/min，5 min離心過濾后留取沉淀物，置于37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱中。采用差速貼壁法分離培養(yǎng)出CFs，經(jīng)免疫組化染色（Vimentin陽性）鑒定證實為CFs，待CFs細(xì)胞生長融合時傳代，3～4代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 實驗分為空白對照組、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干預(yù)組、低濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高濃度AU干預(yù)組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。細(xì)胞長至融合狀態(tài)時，給予相應(yīng)措施。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況 將細(xì)胞均勻接種至96孔板內(nèi)，置于溫箱培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基更換為1%血清的培養(yǎng)基饑餓12 h，各組采用相應(yīng)措施干預(yù)36 h后，將培養(yǎng)基換為含有10 μL CCK-8的無血清培養(yǎng)基100 μL，置于37℃孵育2 h，使用ELISA檢測儀檢測A450值。

1.2.4 ELISA法檢測上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量 將培養(yǎng)細(xì)胞用胰酶消化后計數(shù)，以1000個/孔接種至24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)。待細(xì)胞長至70%～80%融合時，加入含1%血清的培養(yǎng)基饑餓12 h后加入不同處理因素的培養(yǎng)基，36 h后收集上清液。按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。各組細(xì)胞的上清液分別加入包被了抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體的96孔板，溫育2 h后洗滌，加入酶標(biāo)抗體工作液和顯色液，終止反應(yīng)后使用酶標(biāo)儀（波長490 nm）測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量。

1.2.5 ROS的測定 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測。將各組干預(yù)后的細(xì)胞用PBS洗滌2～3次，并加入1 mL DCFH-DA稀釋液（10 μmol/L），孵育20 min，無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，在酶標(biāo)儀下觀察熒光（485 nm為激發(fā)波長，525 nm為發(fā)射波長）。ROS水平（%）=干預(yù)組熒光值/空白對照組熒光值×100%，將空白對照組設(shè)為參考值100%，其余組ROS水平與之對比即得出相對ROS水平。

1.2.6 Western blot法檢測p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞加入組織裂解液，4℃，裂解30 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清，即可獲得總蛋白。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，于濕轉(zhuǎn)槽內(nèi)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)一抗（1∶1000）4℃孵育過夜后，二抗（1∶2000）溶液中室溫孵育1～2 h。加入適量ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity One軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AU對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠CFs增殖的影響

Ang Ⅱ干預(yù)組的OD值較空白對照組明顯升高（P < 0.05）；低濃度AU干預(yù)組CFs增殖活性比Ang Ⅱ干預(yù)組略低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。中、高濃度AU干預(yù)組CFs增殖活性均明顯低于Ang Ⅱ干預(yù)組（P < 0.05），且呈劑量依賴性。見圖1。

2.2 AU對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠CFs產(chǎn)生Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

Ang Ⅱ干預(yù)組的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ含量較空白對照組明顯升高（P < 0.05）；低、中、高濃度AU干預(yù)組的膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成均被顯著抑制（P < 0.05）。見表1。

2.3 AU對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠CFs產(chǎn)生ROS的影響

與空白對照組比較，Ang Ⅱ干預(yù)組CFs的ROS水平明顯升高（P < 0.05）；低、中、高濃度的AU呈濃度依賴性地抑制ROS的產(chǎn)生（P < 0.05）。見圖2。

2.4 AU對p38MAPK蛋白磷酸化的影響

與空白對照組比較，Ang Ⅱ干預(yù)組細(xì)胞中p-p38/p38比例明顯升高（P < 0.05）。與Ang Ⅱ干預(yù)組比較，低濃度AU干預(yù)組的細(xì)胞p-p38/p38比例輕微下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而給予中、高濃度AU干預(yù)組的細(xì)胞p-p38/p38比例相較于Ang Ⅱ干預(yù)組出現(xiàn)明顯的降低（P < 0.05）。見圖3。

3 討論

心肌纖維化的病理表現(xiàn)為心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過度沉積及各型膠原比例失調(diào)且排列紊亂[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，CFs的異常增殖及大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積是心肌纖維化的重要原因。目前，產(chǎn)生ECM的CFs成為藥物治療心肌纖維化的重要靶標(biāo)。本研究探討了AU對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs增殖和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。本研究結(jié)果顯示，AU能呈濃度依賴性地抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs增殖和Col Ⅰ和Col Ⅲ的分泌，提示AU可通過抑制CFs的增殖和減少ECM沉積來抑制心肌纖維化。

ROS是氧化系統(tǒng)中產(chǎn)生的不穩(wěn)定、高活性氧分子化合物的統(tǒng)稱，主要包括含氧自由基、氧的非自由基衍生物、氫過氧化物等，它可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[12-13]。ROS己被證實為心肌纖維化形成和進(jìn)展的重要因素之一。研究[14-15]表明，ROS在CFs增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積過程中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，AU在抑制CFs增殖和下調(diào)Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的同時，ROS生成也顯著下降，提示抑制ROS的生成是AU抑制CFs增殖和下調(diào)Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的的主要機制之一。

MAPK信號通路是介導(dǎo)刺激信號從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核內(nèi)并作出反應(yīng)的一個主要系統(tǒng)[16]。MAPK家族的信號通路主要有3組：外信號調(diào)節(jié)激酶（extra -cellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）和p38-MAPK，均參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[14]。研究[17]表明ROS的產(chǎn)生可激活MAPK信號通路，誘導(dǎo)CFs增殖和ECM過度沉積，從而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，AU在抑制ROS的生成的同時，抑制了p38-MAPK的激活，提示AU可通過抑制ROS-p38MAPK通路來抑制CFs的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的生成。

眾多研究[18-20]表明，中藥對心肌纖維化具有良好的療效，如：野黃芩苷、橙皮素和柚皮苷等。本研究提示，AU可通過抑制ROS-MAPK通路的激活，有效地抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs的增殖和ECM的生成，這一結(jié)論為研發(fā)以AU為基礎(chǔ)的抗心肌纖維化藥物提供了理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會疾病預(yù)防控制局.中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告（2015年）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2015.

[2] 陳偉偉，高潤霖，劉力生，等.《中國心血管病報告2015》概要[J].中國循環(huán)雜志，2016，31（6）：521-528.

[3] 董浩，韓旭晨，劉巍.抗心肌纖維化治療的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2017，45（10）：1521-1524.

[4] 馬金，丁春華.心臟成纖維細(xì)胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272.

[5] 韓曼飛，張劉強，李醫(yī)明.天然桃葉珊瑚苷及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2017，48（19）：4105-4113.

[6] 阮德功，馬龍，許暉，等.杜仲翅果桃葉珊瑚甙抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（8）：120-122.

[7] 鄭杰，劉端，趙肅清，等.杜仲葉桃葉珊瑚苷的酶法提取及其抑菌活性[J].中藥材，2012，35（2）：304-306.

[8] Xue HY，Gao GZ，Lin QY，et a1. Protective effects of aucubin on H202.Induced apoptosis in PCI2 cells [J]. Phytother Res，2012，26（3）：369-374.

[9] Lyu PY，F(xiàn)eng H，Huang WH，et al. Aucubin and its hydrolytic derivative attenuate activation of hepatic stellate cells via modulation of TGF-β stimulation [J]. Environ Toxicol Pharmacol，2017，50（3）：234-239.

[10] 于瑞，王幼平，崔琳，等.心肌纖維化的發(fā)病機制及其研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2015，53（13）：157-160.

[11] 李乾，常亮，蘇冬梅，等.粉防己堿對心肌成纖維細(xì)胞增殖、活化的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2018，50（2）：331-334.

[12] 董文珠，曹曉倩，王璐，等.AngⅡ-ROS-PKC/Nrf2/HO-1通路調(diào)控LX-2細(xì)胞增殖的機制研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，42（4）：319-325.

[13] 賴銀璇，王明蕊，楊海麗，等.柚皮素通過ROS/JNK/Bcl2通路抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和遷移[J].中藥藥理與臨床，2018，34（1）：40-43.

[14] 李夢，錢海兵.ROS-MAPK信號通路與心肌纖維化的研究進(jìn)展[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，33（1）：166-168.

[15] 孟哲，李海禹，陶海龍.基于TGF-β1/Smad3信號通路探討蝦青素對心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2018，34（6）：841-845.

[16] 韋立群，李清，甘嘉亮，等.迷迭香酸衍生物RAD-9通過PI3K/Akt和p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡[J].中國藥理學(xué)通報，2018，34（2）：256-259.

[17] Dai H，Jia G，Lu M，et al. Astragaloside IV inhibits isoprenaline-induced cardiac fibrosis by targeting the reactive oxygen species/mitogen activated protein kinase signaling axis [J]. Mol Med Rep，2017，15（4）：1765-1770.

[18] 辛博，陳力，萬麗麗，等.野黃芩苷對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖及ERK1/2、p38 MAPK信號通路的影響[J].中國藥房，2018，29（5）：629-633.

[19] 胡哲夫，唐其柱，劉源，等.橙皮素對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響[J].疑難病雜志，2015， 14（4）：376-379.

[20] 張羽飛，孟娜娜，李厚忠，等.柚皮苷對糖尿病大鼠心肌纖維化及 STAT3 磷酸化水平的影響[J].藥物評價研究，2018，41（1）：48-54.

（收稿日期：2018-09-26 本文編輯：金 虹）