西瓜果實(shí)表皮蠟粉的化學(xué)成分與基因定位

龔成勝，趙勝杰，路緒強(qiáng)，何楠，朱紅菊，豆峻嶺，袁平麗，李兵兵，劉文革

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所/國家瓜果改良中心，鄭州 450009）

0 引言

【研究意義】西瓜（Citrullus lanatus）屬于葫蘆科西瓜屬，是重要的瓜果類作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。我國是世界上最大的西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)大國，西瓜在我國果蔬生產(chǎn)和周年供應(yīng)中占據(jù)重要地位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年我國西瓜播種面積已增至1.89×106hm2，總產(chǎn)量達(dá)7 940萬t[1-2］。植物蠟粉又稱蠟質(zhì)、蠟被，它是存于植物組織表面的疏水性晶體結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在農(nóng)作物生長發(fā)育過程中，表皮蠟質(zhì)能夠有效地保護(hù)植株，進(jìn)而提高農(nóng)作物的質(zhì)量、產(chǎn)量和抗性。附著于西瓜果實(shí)表皮白色粉末狀物質(zhì)即為蠟粉，目前，用于生產(chǎn)銷售的西瓜主栽培品種果實(shí)表皮大多有蠟粉附著，然而尚沒有對(duì)西瓜蠟粉性狀的系統(tǒng)研究。對(duì)西瓜果實(shí)表皮蠟粉的研究有助于闡明性狀的抗性機(jī)制，同時(shí)可以為新品種選育和遺傳機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)，因此本研究的開展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蠟粉一般為灰綠、灰白霜狀，廣泛分布于玉米、葡萄、甘藍(lán)、黃瓜、西瓜等多種植物中，它存在于不同植物葉、莖、嫩枝、果實(shí)等不同組織部位，而目前對(duì)它的研究多集中在葉片上，植物果實(shí)表皮蠟粉的研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，蠟粉在植物生長發(fā)育過程中起到重要的保護(hù)作用，它能夠減少水分蒸發(fā)和外部水分進(jìn)入植物組織、減緩高溫脅迫[3-4］、減少紫外線損傷[5］，同時(shí)還具有抵抗部分病蟲侵害的作用[6］。蠟粉的形態(tài)和化學(xué)成分變異豐富，常見的蠟粉形態(tài)結(jié)構(gòu)有柱狀、棒狀、樹枝狀和板狀[7］等；蠟粉的主要組成成分為特長鏈脂肪酸及其衍生物，可能還存在一些萜類等成分。在蠟粉組分合成時(shí)，脂肪酸延伸酶復(fù)合體（FAE）催化特長鏈脂肪酸（VLCFAs）C16、C18的形成，然后通過醇合成途徑合成初級(jí)醇和烷基酯，或者通過烷烴合成途徑合成烷烴、次級(jí)醇、酮和醛[8-9］等物質(zhì)。目前，關(guān)于植物蠟粉的遺傳規(guī)律已有較多的報(bào)道，劉東明等[10］以葉片無蠟粉亮綠油菜LD10和葉片有蠟粉甘藍(lán)21-3為雙親構(gòu)建六世代群體，遺傳分析表明蠟粉為單基因控制顯性性狀；張曦等[11］以大白菜花莖有蠟粉的材料‘08A161’為母本，無蠟粉的材料‘08A235-2’為父本構(gòu)建了六世代群體，遺傳分析表明花莖蠟粉為核基因控制，有蠟粉對(duì)無蠟粉表現(xiàn)為完全顯性。近年來，植物蠟粉合成的相關(guān)基因被不斷的挖掘，如擬南芥中的FAE1編碼的蛋白特異催化C20、C22脂肪酸的合成[12］，CER10編碼的烯酰 CoA還原酶（ECR）是合成長鏈脂肪酸所必需[13］，CER4編碼的脂酰CoA還原酶（FAR）負(fù)責(zé)催化表皮初級(jí)醇的合成[14］，CER3則被認(rèn)為和醛類物質(zhì)合成有關(guān)[15］。相關(guān)蠟質(zhì)生成的基因也在玉米、水稻等多種作物中被克隆?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】迄今，對(duì)植物蠟粉的生理生化作用以及遺傳機(jī)制研究不斷深入，但西瓜果實(shí)表皮蠟粉結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分還不清楚，對(duì)性狀的遺傳分析和基因定位工作也未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)以無蠟粉的西瓜自交系‘FH’和有致密蠟粉層附著的西瓜自交系‘美佳選黑’為雙親構(gòu)建六世代群體，通過雙親果實(shí)表皮結(jié)構(gòu)觀察、蠟粉化學(xué)成分測(cè)定、群體遺傳分析以及基因定位工作的開展，為新品種選育提供理論支撐，同時(shí)為今后進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位和分子標(biāo)記輔助育種奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用‘美佳選黑’和‘FH’為供試材料，這兩份材料均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所多倍體西瓜育種課題組選育的高代自交系?！兰堰x黑’果實(shí)橢圓形，果實(shí)底色墨綠，表皮光滑，無蠟粉層附著（圖1-A）；‘FH’果實(shí)高圓型，果實(shí)底色墨綠，表皮有灰白色蠟粉層附著（圖 1-B）。將‘美佳選黑’和‘FH’分別作為母本 P1和父本 P2，通過人工授粉雜交的方式獲得 F1群體，F(xiàn)1自交獲得 F2群體，F(xiàn)1與P1、P2雜交分別獲得BC1P2、BC1P2群體。供試材料于2018年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新鄉(xiāng)綜合實(shí)驗(yàn)基地大棚，育苗移栽，行間距1.5 m，株間距0.8 m，地膜覆蓋，單蔓整枝，第二雌花自交授粉留瓜，西瓜雌、雄花于開花前1 d下午進(jìn)行套帽，在次日10：00前進(jìn)行人工授粉，田間施肥、灌溉等栽培管理措施一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 西瓜果實(shí)表皮蠟粉的結(jié)構(gòu)觀察 供試材料‘美佳選黑’和‘FH’果實(shí)生長至成熟期時(shí)，用單面美工刀片分別在兩份材料外果皮中部相同位置處取大小為1 cm×0.5 cm×0.3 cm的長方體樣品，注意不要觸碰果皮，以保證蠟粉的完整性，每個(gè)樣本設(shè)置3次重復(fù)。然后通過以下5個(gè)步驟處理樣品。第一步：化學(xué)固定。所取樣品立即用pH 7.2的2.5%戊二醛進(jìn)行固定。第二步：清洗。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，每次清洗15 min。第三步：脫水。依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、75%、85%、95%、100%、100%的乙醇溶液各清洗20 min。第四步：干燥。在臨界點(diǎn)干燥器中用液體作為置換劑置換中間介質(zhì)，進(jìn)行臨界干燥。第五步：噴金。將干燥的樣品用導(dǎo)電性好的粘合劑粘在金屬樣品臺(tái)上，隨后放在真空蒸發(fā)器中噴鍍一層50—300 ?厚的金屬膜。處理好的樣品在掃描電子顯微鏡下利用二次電子成像原理實(shí)現(xiàn)對(duì)表皮結(jié)構(gòu)的觀察。試驗(yàn)使用英國Quorum K850進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥，使用FEI Quanta 250掃描電子顯微鏡進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察。樣品制備和掃描電鏡觀察由河大科技公司協(xié)助完成。

1.2.2 西瓜果實(shí)表皮蠟粉成分的提取與檢測(cè) 供試材料‘FH’果實(shí)成熟時(shí)，用單面美工刀片刮取果實(shí)表皮附著的白色蠟粉，注意避免刮到果皮。電子天平精確稱量0.01 g蠟粉于2 mL密封玻璃瓶，然后加入1 mL三氯甲烷提取蠟質(zhì)成分，待提取液蒸干后，加入50 μg正二十四烷作為內(nèi)標(biāo)，加入100 μL N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺作為衍生試劑，橡皮塞蓋好玻璃瓶后用封口膜進(jìn)行密封，接著將樣品放于65℃水浴中衍生1 h，衍生完成后用氮吹儀吹去衍生試劑，再加入1 mL三氯甲烷進(jìn)行溶解，隨后用0.22 μm有機(jī)系濾頭進(jìn)行過濾，得到待測(cè)液。取1 μL待測(cè)液進(jìn)行GC-MS分析，3次重復(fù)。以不同時(shí)間點(diǎn)的峰面積為指標(biāo)，定量各化學(xué)成分，各物質(zhì)的離子峰面積與有效提取物總離子峰面積的比值作為該物質(zhì)的相對(duì)含量占比。

應(yīng)用美國Agilent公司生產(chǎn)的7890A-5975C頂空G1888氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行蠟粉成分分析。參數(shù)設(shè)置如下，色譜柱：DB5-MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細(xì)管柱，脈沖不分流進(jìn)樣，壓強(qiáng)為270 kPa，保持0.7 min。襯管型號(hào)：19251-6050，進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣口溫度設(shè)置為300℃。爐溫箱的起始溫度為50℃，并以40℃·min-1的速度升溫至200℃，保持1 min，然后以3℃·min-1的速度升溫至300℃，并保持15 min。檢測(cè)溫度為 300℃，四級(jí)桿溫度為 150℃，離子源溫度230℃，模式設(shè)置為全掃模式，掃描范圍50—550 amu。試驗(yàn)在鄭州果樹研究所果品質(zhì)量檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室完成。檢測(cè)方法參考羅倩等[16］。

1.2.3 西瓜果實(shí)表皮蠟粉性狀的鑒定與統(tǒng)計(jì) 本試驗(yàn)將西瓜果實(shí)表皮蠟粉性狀表型定義為有和無，果實(shí)成熟時(shí)通過目測(cè)法進(jìn)行鑒定。親本及后代群體P1、P2、F1、F2、BC1P1、BC1P2的種植株數(shù)分別為 50、50、50、714、279、50。使用SAS 9.2軟件進(jìn)行顯著性分析。

1.2.4 基因池的建立與重測(cè)序 試驗(yàn)采用集團(tuán)分離分析法，即BSA法，對(duì)西瓜果實(shí)表皮蠟粉性狀進(jìn)行基因定位。在F2分離群體中，選取果實(shí)表皮有蠟粉和無蠟粉的西瓜各 30株，分別取幼嫩葉片并保存在液氮中，用植物基因組 DNA提取試劑盒分別提取樣品DNA，然后將極端性狀單株的 DNA等量混合構(gòu)建2個(gè)混池（R03、R04），加上兩個(gè)雙親池（R01、R02），共構(gòu)建4個(gè)DNA池。構(gòu)建的基因池送至北京百邁客生物有限公司進(jìn)行建庫和測(cè)序，試驗(yàn)選用 Illumina HiSeq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，試驗(yàn)的流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol執(zhí)行。DNA提取試劑盒購自洛陽愛森生物科技有限公司。

1.2.5 關(guān)聯(lián)分析與候選基因挖掘 重測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控及過濾后，使用 bwa軟件與西瓜參考基因組‘97103’[17］進(jìn)行比對(duì)。接著使用GATK等軟件對(duì)檢測(cè)得到的高質(zhì)量 SNP、InDel進(jìn)行變異檢測(cè)，然后通過ED、SNP-index對(duì)SNP進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過ED、InDel-index對(duì)InDel進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，綜合關(guān)聯(lián)分析結(jié)果獲得可能控制該性狀的候選區(qū)間。進(jìn)一步通過KEGG、COG 、GO等數(shù)據(jù)庫完成候選區(qū)間的深度基因注釋，并通過突變位點(diǎn)分析挖掘候選基因，最終獲得可能控制西瓜果實(shí)表皮蠟粉生成的候選基因。

2 結(jié)果

2.1 西瓜果實(shí)表皮蠟粉的形態(tài)特征與結(jié)構(gòu)

通過肉眼觀察，在供試材料中，無蠟粉西瓜‘美佳選黑’果實(shí)表皮光滑，無蠟粉層附著（圖 1-A）。而有蠟粉西瓜‘FH’果實(shí)表皮附著一層致密的灰白色霜狀物質(zhì)，即為西瓜果實(shí)表皮蠟粉（圖 1-B），同時(shí)，田間材料觀察發(fā)現(xiàn)，無蠟粉西瓜比有蠟粉材料更容易產(chǎn)生日灼傷。

圖1 成熟西瓜果實(shí)表皮形態(tài)比較Fig. 1 The morphology comparison of ripe watermelon fruit epidermis

掃描電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，西瓜果實(shí)表皮凹凸不平，氣孔不均勻分布在表皮上，‘美佳選黑’果實(shí)表皮在果皮凹陷處光滑（圖 2-A，圖 2-C），未觀察到絨毛狀晶體結(jié)構(gòu)；而‘FH’果實(shí)表皮凹陷及氣孔附近觀察到豐富的灰白色蠟粉晶體，呈板狀結(jié)構(gòu)，長度約5 μm（圖2-B，圖2-D）。

2.2 西瓜果實(shí)表皮蠟粉的化學(xué)成分

GC-MS實(shí)現(xiàn)了對(duì)西瓜果實(shí)表皮蠟粉各組分的有效分離（圖3），共分離鑒定出24種已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)（表1），包括烴類物質(zhì)10種，醇類5種，酯類5種，酸類2種，酚類1種，醛類1種。其中，烴類物質(zhì)相對(duì)含量占比高達(dá)77.72%，烷烴的碳原子變化范圍為 C17—C36，主要包括 C17、C26、C27、C28、C29、C32、C33、C34、C36的正鏈烷烴，正三十四烷相對(duì)含量占比最高，為40.76%；醇類相對(duì)含量占比為12.60%，包括3個(gè)初級(jí)醇和2個(gè)次級(jí)醇，其中1,30-三十烷二醇占比最高，為11.55%；酯類、酸類、酚類和醛類的相對(duì)含量占比依次為12.60%、0.43%、0.53%、0.80%、3.99%。檢測(cè)結(jié)果表明，西瓜表皮蠟粉主要由脂肪族化合物烴類、醇、酯、脂肪酸和醛組成，其中烷烴的相對(duì)含量占比最高。

2.3 西瓜果實(shí)表皮蠟粉性狀的遺傳分析

田間性狀表型鑒定統(tǒng)計(jì)顯示（表2），在F1群體中，成熟西瓜果實(shí)表面均有致密蠟粉層；在F2群體中，性狀出現(xiàn)分離。其中，529株西瓜表皮有蠟粉，185株西瓜表皮無蠟粉，分離比例經(jīng)過卡方檢驗(yàn)基本符合3∶1的孟德爾分離比例（χ2=0.32＜χ20.05=3.841）；BC1P1群體中有蠟粉和無蠟粉西瓜株數(shù)分別為150株129株，分離比符合1∶1的理論比（χ2=1.58＜χ20.05=3.841），BC1P2西瓜單株果實(shí)表皮均附著蠟粉。遺傳規(guī)律分析表明，西瓜果實(shí)表皮蠟粉性狀的有或無是質(zhì)量性狀，其遺傳受一對(duì)顯性基因控制，有蠟粉對(duì)無蠟粉為顯性。

圖2 掃描電鏡下西瓜果實(shí)表皮蠟粉結(jié)構(gòu)Fig. 2 Wax powder structure of watermelon fruit epidermis under scanning electron microscope

圖3 西瓜果實(shí)表皮蠟粉的GC-MS總離子流分析Fig. 3 Total ion chromatograph of GC-MS for compounds in epicuticular wax of watermelon fruit

表1 西瓜果實(shí)表皮蠟粉的組成成分與相對(duì)含量Table 1 Composition and relative content of wax powder from watermelon fruit epidermis

表2 六世代群體植株分離情況統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of plant separation in six generations population

2.4 西瓜果實(shí)表皮蠟粉性狀的基因定位

2.4.1 Illumina HiSeq測(cè)序結(jié)果 對(duì)構(gòu)建的4個(gè)基因池進(jìn)行全基因組重測(cè)序，共獲得56.02 Gb的數(shù)據(jù)量，過濾后得到55.47 Gb的數(shù)據(jù)，Q30達(dá)到80%，4個(gè)樣品的平均測(cè)序深度為39.06×。樣品同參考基因組的平均比對(duì)效率為99.08%，平均覆蓋深度為30.50×，基因組覆蓋度99.57%，保證了至少一個(gè)堿基的覆蓋。測(cè)序結(jié)果表明，樣品數(shù)據(jù)量充足，測(cè)序質(zhì)量合格，成功完成測(cè)序和建庫工作，可用于后續(xù)的變異檢測(cè)及性狀的基因定位。

2.4.2 SNP關(guān)聯(lián)分析 SNP變異檢測(cè)共獲得了144 533個(gè)高質(zhì)量 SNP，這些 SNP采用歐式距離（euclidean distance，ED）和SNP-index兩種方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

ED算法通過尋找混池間存在顯著差異標(biāo)記，來對(duì)目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的區(qū)域進(jìn)行評(píng)估。ED值計(jì)算參見HILL等[18］研究，本項(xiàng)目取原始ED的2次方作為關(guān)聯(lián)值，然后采用DISTANCE方法對(duì)ED值進(jìn)行擬合，取全部位點(diǎn)擬合值的 median+3SD作為分析的關(guān)聯(lián)閾值。根據(jù)計(jì)算得ED分析關(guān)聯(lián)閾值為0.17，結(jié)合關(guān)聯(lián)閾值判定，共獲得8個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)域（圖4-a），長度大小為5.95 Mb，分別在：Chr1（2.97—4.98 Mb），Chr2（28.88—30.07 Mb），Chr5（0—2.37 Mb），Chr9（1.49—1.50 Mb、1.53—1.58 Mb、1.74—1.74 Mb、1.76—1.98 Mb、2.04—2.14 Mb）。

SNP-index通過尋找混池間基因型頻率的顯著差異Δ(SNP-index)進(jìn)行標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析，目標(biāo)性狀與標(biāo)記SNP關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)，Δ(SNP-index)的值越接近于1。采用SNP-index方法關(guān)聯(lián)分析時(shí)，利用擬合后 Δ（SNP-index）的99百分位數(shù)計(jì)算關(guān)聯(lián)閾值，計(jì)算得到關(guān)聯(lián)閾值為0.19。依據(jù)參考閾值，共獲得9個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)域（圖4-b），總長度大小為3.19 Mb，這9個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)域在參考基因組上的位置為：Chr1（0—0.63 Mb、2.37—2.40 Mb、2.95—4.99 Mb），Chr6（10.27—10.34 Mb、10.36—10.36 Mb、16.54—16.89 Mb、17.01—17.02 Mb、17.04—17.07 Mb、17.10—17.11 Mb）。

兩種關(guān)聯(lián)分析方法的關(guān)聯(lián)區(qū)域在 1號(hào)染色體2.97—4.98 Mb處存在交集，區(qū)間大小為2.01 Mb，包含172個(gè)基因。

2.4.3 InDel關(guān)聯(lián)分析 InDel變異檢測(cè)獲得高質(zhì)量InDel位點(diǎn)50 258個(gè)，使用ED和InDel-index兩種關(guān)聯(lián)分析方法對(duì)這些InDel進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析方法與SNP分析所用的方法相同。

圖4 基于SNP的ED和Δ(SNP-index)關(guān)聯(lián)分析圖Fig. 4 ED and delta (SNP-index) correlation analysis chart based on SNP

ED關(guān)聯(lián)分析計(jì)算得關(guān)聯(lián)閾值為0.19。根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值進(jìn)行判定，共獲得了5個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)域（圖5-a），總長度大小為 6.69 Mb，對(duì)應(yīng)參考基因組上位置分別為：Chr1（3.00—5.02 Mb，Chr5（0—2.39 Mb），Chr6（10.14—10.16 Mb、10.18—11.15 Mb、8.87—10.07 Mb）。InDel-index方法分析時(shí)計(jì)算得到關(guān)聯(lián)閾值為0.17，共得到6個(gè)區(qū)域（圖5-b），總長度大小為3.25 Mb，關(guān)聯(lián)區(qū)域分別位于：Chr1（3.16—4.48 Mb），Chr6（10.21—10.41 Mb、10.43—11.15 Mb、13.54—13.64 Mb、13.66—14.11 Mb、15.13—15.23 Mb）。

兩種方法取交集共得到2.6 Mb關(guān)聯(lián)區(qū)域，分別位于 1號(hào)染色體起始位置 3.16—4.84 Mb，6號(hào)染色體10.21—10.41 Mb和10.43—11.15 Mb處，關(guān)聯(lián)區(qū)域包含182個(gè)基因。

圖5 基于InDel的ED和Δ(InDel-index)關(guān)聯(lián)分析Fig. 5 ED and delta (InDel-index) correlation analysis based on InDel

將SNP和InDel關(guān)聯(lián)分析結(jié)果取交集得到1號(hào)染色體3.16—4.84 Mb共1.68 Mb的關(guān)聯(lián)區(qū)域，該區(qū)域共144個(gè)基因。4種關(guān)聯(lián)分析方法在該區(qū)域均有較高的峰值，說明在關(guān)聯(lián)區(qū)域中可能存在西瓜果實(shí)表皮蠟粉生成相關(guān)的基因。

2.4.4 候選區(qū)域的基因功能注釋 為進(jìn)一步對(duì)關(guān)聯(lián)區(qū)域的基因進(jìn)行挖掘，快速篩選獲得與性狀相關(guān)的基因，本試驗(yàn)利用 BLAST軟件對(duì)候選區(qū)間的編碼基因進(jìn)行KEGG和COG、GO等多個(gè)數(shù)據(jù)庫的深度注釋。KEGG數(shù)據(jù)庫通過對(duì)基因間作用通路對(duì)基因的功能進(jìn)行解讀，注釋結(jié)果顯示（圖 6），富集到注釋基因種類最多的依次為淀粉與蔗糖代謝、嘌呤代謝、核糖體、半乳糖代謝等。COG數(shù)據(jù)庫能夠?qū)虍a(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類，注釋結(jié)果顯示（圖 7），富集較多注釋基因的為防御機(jī)制、次生代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝、碳水化合物運(yùn)輸與代謝、翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生等。在候選區(qū)間中，多個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)共注釋到138個(gè)基因（表3）。在被注釋到的基因中（表4），非同義突變基因10個(gè)，移碼突變基因1個(gè)，這些突變的產(chǎn)生很可能與目標(biāo)性狀的表達(dá)差異有關(guān)。

2.4.5 候選基因的預(yù)測(cè) 結(jié)合參考基因組和數(shù)據(jù)庫的基因注釋發(fā)現(xiàn)，Cla002367基因注釋的信息為烯酰ACP-還原酶（ECR），該基因編碼的酶在特長鏈脂肪酸（VLCFAs）生物合成過程中起重要催化作用；Cla011514、Cla002337和Cla002342基因注釋結(jié)果為細(xì)胞色素P450（CYP），研究表明，部分P450家族基因的編碼蛋白能夠通過催化烷基的羥化、烴基的氧化等生物學(xué)反應(yīng)影響脂肪族化合物的生成；Cla002353基因注釋信息為 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，蠟質(zhì)組分從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到質(zhì)外體的過程中，需要在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體作用下進(jìn)行。因此，推測(cè)這5個(gè)非同義突變基因可能與西瓜果實(shí)表皮蠟粉的生成有關(guān)。

圖6 候選區(qū)域內(nèi)基因的KEGG功能分類Fig. 6 KEGG functional classification of genes in candidate regions

圖7 候選區(qū)域內(nèi)基因的COG功能分類Fig. 7 COG functional classification of genes in candidate regions

進(jìn)一步根據(jù) DNA池的重測(cè)序數(shù)據(jù)及參考基因組信息，對(duì)5個(gè)潛在候選基因的SNP變異情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，5個(gè)潛在候選基因由于編碼區(qū)堿基序列的變異，導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變：Cla002367基因在4 208 461位置堿基處G突變成A，導(dǎo)致無蠟粉親本蛋白序列第161位氨基酸發(fā)生改變（圖8）；Cla011514、Cla002337和Cla002342基因分別在3 302 452、4 550 489和4 513 862位置處發(fā)生C→T、G→A、T→C單堿基的突變并引物氨基酸的改變（圖 8）；在無蠟粉親本中，Cla002353在4 383 332位置處堿基由C突變成T，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的提前終止，并在第708位置發(fā)生氨基酸終止編碼（圖8）。因此，推測(cè)以上5個(gè)基因?yàn)槲鞴瞎麑?shí)表皮蠟粉性狀的候選基因。

表3 候選區(qū)域內(nèi)基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 The statistical results of gene function annotation in candidate regions

表4 候選區(qū)域內(nèi)非同義突變基因和移碼突變基因功能注釋Table 4 Functional annotation of non synonymous mutations and frameshift mutations in candidate regions

3 討論

3.1 植物蠟質(zhì)具有保護(hù)作用

植物表皮蠟質(zhì)具有重要保護(hù)作用，對(duì)表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究有助于理解蠟質(zhì)與環(huán)境的互作機(jī)制。蠟質(zhì)的結(jié)構(gòu)變異豐富,BARTHLOTT等[7］利用掃描電子顯微鏡對(duì)13 000多種植物表皮蠟質(zhì)進(jìn)行了觀察，將蠟質(zhì)的結(jié)構(gòu)分成柱狀、板狀、管狀等23類。根據(jù)其對(duì)不同植物表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的分類描述，發(fā)現(xiàn)西瓜品種‘FH’果實(shí)表皮蠟粉符合板狀結(jié)構(gòu)的特征，蠟質(zhì)晶體緊密地排列在一起,形成果實(shí)表皮灰白色霜狀蠟粉層，而無蠟粉西瓜品種‘美佳選黑’表皮光滑，無蠟粉層附著。致密的蠟粉層對(duì)植物的保護(hù)作用不斷被研究，如周會(huì)玲等[19］對(duì)‘巨峰’‘紅地球’‘秋紅’‘秋黑’葡萄果實(shí)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)層厚、分布均勻且致密的品種耐儲(chǔ)藏性更強(qiáng)；李宏建等[20］通過多功能熒光顯微鏡對(duì)不同蘋果品種果實(shí)表皮細(xì)胞大小、蠟質(zhì)層等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)排列緊湊、蠟質(zhì)厚的品種失水率較低。緊密排列的蠟粉層附著于西瓜表皮，相當(dāng)于給西瓜果實(shí)穿上了一層“外衣”，從而減輕不良環(huán)境對(duì)果實(shí)造成的損害。

3.2 蠟粉主要由脂肪族化合物組成

于海寧等[21］研究發(fā)現(xiàn)，脂肪族化合物是植物表皮蠟質(zhì)最常見的化學(xué)成分，包括長鏈脂肪酸、醛、醇等物質(zhì)，碳鏈長度一般為 C18—C36，這與本研究的結(jié)果相符合。對(duì)蠟質(zhì)化學(xué)成分進(jìn)行研究也有助于了解組成成分的合成通路。本研究利用 GC-MS分析發(fā)現(xiàn)西瓜果實(shí)蠟粉由脂肪族化合物烷烴（10種）、醇（5種）、酯（5種）、脂肪酸（2種）和醛（1種）組成，其中C17—C36正鏈烷烴的相對(duì)含量在蠟粉提取化合物中占比非常高，為77.72%。雖然蠟粉的化學(xué)成分種類相似，但不同植物化學(xué)物質(zhì)含量有所差異，如與西瓜果實(shí)表皮蠟粉中烷烴占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)不同，王金秋等[9］研究發(fā)現(xiàn) 3個(gè)品種柑橘果實(shí)表皮蠟質(zhì)成分均以醛（41%—50%）為主，烷烴或酸次之，伯醇最少；BAUER等[22］對(duì)3個(gè)茄子果實(shí)表皮蠟粉成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蠟粉成分主要為烷烴和醛類物質(zhì)，占比77.00%。目前，蠟粉化學(xué)成分合成途徑已經(jīng)清楚，VLCFAs在質(zhì)體中合成后，通過醇合成途徑合成初級(jí)醇和烷基酯，或者經(jīng)過烷烴合成途徑合成烷烴、次級(jí)醇、酮和醛等物質(zhì)。西瓜果實(shí)表皮蠟粉的24種化學(xué)成分涉及以上兩條代謝途徑，說明在西瓜中，果實(shí)表皮蠟粉同樣是通過前體物質(zhì)形成VLCFAs，然后通過兩條合成途徑生成各化學(xué)成分，無蠟粉西瓜果實(shí)表皮未形成致密蠟粉層，可能與蠟粉化學(xué)成分合成途徑受阻有關(guān)。

3.3 基因定位與候選基因分析

本試驗(yàn)建立了六世代群體，并對(duì)性狀鑒定結(jié)果進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明西瓜表皮蠟粉是由單基因控制的質(zhì)量性狀，有蠟粉為顯性性狀。目前還沒有有關(guān)蠟粉遺傳規(guī)律的研究報(bào)道，本研究結(jié)果豐富了西瓜表皮蠟粉的研究內(nèi)容，同時(shí)對(duì)育種工作具有一定的指導(dǎo)作用。近年來，由于測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基于全基因組測(cè)序的BSA-seq技術(shù)也得到了相應(yīng)的發(fā)展，并在玉米[23］、白菜[24］、桃[25］、油菜[26］、西瓜[27］等多種作物中大量應(yīng)用，并定位到一大批與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的候選基因，該方法適合對(duì)單基因控制的質(zhì)量性狀或數(shù)量性狀的主效基因進(jìn)行定位，因此，采用BSA技術(shù)對(duì)西瓜果實(shí)表皮蠟粉進(jìn)行基因定位合理可行。本研究采用4種關(guān)聯(lián)算法對(duì)BSA-seq檢測(cè)到的高質(zhì)量SNP和InDel進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將4種關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果取交集后得到1號(hào)染色體3.16—4.84 Mb，共1.68 Mb的區(qū)域內(nèi)。但由于BSA無法精準(zhǔn)獲得目標(biāo)性狀的調(diào)控基因，所以本試驗(yàn)對(duì)關(guān)聯(lián)區(qū)域的基因進(jìn)行進(jìn)一步的基因注釋分析，以挖掘候選基因。

候選區(qū)域138個(gè)有注釋信息的基因中存在10個(gè)非同義突變的基因和1個(gè)移碼突變基因。進(jìn)一步對(duì)這11個(gè)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Cla002367為ECR類基因，它所編碼的蛋白屬于脂肪酸延伸酶復(fù)合物（FAE）的組成成分，乙酰輔酶A在FAE催化下經(jīng)過縮合、還原、脫水、再還原四步反應(yīng)后延伸?；溕蒝LCFAs，四步反應(yīng)依次經(jīng)過β-酮脂酰輔酶A合酶(KCS)、β-酮脂酰輔酶 A還原酶（KCR）、β-羥酰輔酶 A脫水酶（HCD）、烯酰輔酶A還原酶(ECR)催化完成。其中，再還原步驟是在 ECR的催化作用下反應(yīng)完成。KOHLWEIN等[28］首次從一個(gè)酵母突變體tsc13中分離了得到TSC13，該基因負(fù)責(zé)編碼ECR，其編碼蛋白能夠與酵母KCS-Elo2p和Elo3p共同作用催化VLCFAs的合成；在擬南芥中，對(duì) cer10突變體和酵母突變體的互補(bǔ)研究說明CER10編碼一個(gè)功能性的ECR[13,29］，CER10的突變導(dǎo)致VLCFAs合成受阻；趙利[30］等從構(gòu)建的木奈cDNA文庫中得到一個(gè)ECR基因PsECR，對(duì)該基因在葉片不同生長發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)分析表明，該基因很可能參與葉片蠟質(zhì)合成的調(diào)控。在擬南芥ecr2突變體中，表皮蠟粉碳鏈長度最多達(dá)到C28，說明ECR2在C28延長過程中發(fā)揮著重要的作用[31］。Cla011514、Cla002337、Cla002342這3個(gè)基因注釋信息為細(xì)胞色素P450家族基因。P450作為一類很大的可自身氧化的亞鐵紅素蛋白家族，主要參與的反應(yīng)有烷基的羥化、烯基的環(huán)氧化、烴基的氧化等[32］。如P450 BM3是脂肪酸羥基化酶，對(duì)碳鏈長C12—C40正鏈烷烴以及脂肪酸具有很高的催化活性，同時(shí)還可以催化一些雜環(huán)化合物[33-34］；P450 2B4結(jié)構(gòu)適應(yīng)性強(qiáng)，催化完成C-H鍵的羥基化[35-36］，在脫羰基等反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。西瓜果實(shí)表皮蠟粉成分主要為烴類、醇類和酯類的脂肪族有機(jī)化合物，所以猜測(cè)候選區(qū)域內(nèi)存在的3個(gè)細(xì)胞色素P450家族基因的編碼蛋白可能參與西瓜蠟粉組成成分的合成。Cla002353與 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)，蠟質(zhì)分子在運(yùn)輸?shù)倪^程中，通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外基質(zhì)，雖然目前轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還沒完全被揭示，但ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體在蠟質(zhì)運(yùn)輸過程中發(fā)揮的重要作用毋庸置疑，如在擬南芥中，CER5和WBC11是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，基因缺失的突變體中表皮蠟質(zhì)含量減少[37-38］。綜上所述，可以推測(cè)以上5個(gè)基因可能和西瓜蠟粉生成與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

本研究對(duì)西瓜表皮蠟粉性狀進(jìn)行初步定位并對(duì)候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，為完善蠟粉合成基因的定位工作打下基礎(chǔ)，可以進(jìn)一步的開發(fā)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，并在子代分離群體中篩選重組單株，進(jìn)而縮小候選區(qū)域，實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位。

4 結(jié)論

西瓜果實(shí)表皮蠟粉為板狀結(jié)構(gòu)，主要是由脂肪族化合物組成，且烷烴成分的相對(duì)含量占比最高。遺傳分析表明西瓜蠟粉是由單基因控制的質(zhì)量性狀，有蠟粉對(duì)無蠟粉為顯性。利用BSA獲得1號(hào)染色體1.68 Mb的關(guān)聯(lián)區(qū)域，并預(yù)測(cè)該區(qū)域中Cla002367、Cla011514、Cla002337、Cla002342、Cla002353共5個(gè)非同義突變基因?yàn)檎{(diào)控西瓜果實(shí)表皮蠟粉性狀的候選基因。