紫蘇茉莉酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶基因PfJMT的克隆及表達分析

白輝揚，魯庚，陸俊杏，管麗，唐鑫，張濤

（重慶師范大學生命科學學院，重慶401331）

0 引言

【研究意義】JA及其衍生物MeJA是植物防御以及多種發(fā)育過程（如種子萌發(fā)、開花、果實發(fā)育和衰老）的重要細胞調(diào)節(jié)劑[1-3］。JMT是MeJA生物合成的關鍵酶，負責將JA甲基化為MeJA[4］。通過對JMT表達模式的研究，對植物防御和植物發(fā)育的調(diào)控，以及進一步利用JMT改良作物品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】茉莉酸起源于α-亞麻酸，在質(zhì)體中經(jīng)脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）氧化，然后通過丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase，AOS）和丙二烯氧化物環(huán)化酶（allene oxide cyclase，AOC）轉(zhuǎn)化為12-氧代植二烯酸（12-OPDA），再轉(zhuǎn)運到過氧化物酶體，最后經(jīng)過3次β氧化形成茉莉酸[5-7］。JA有多種代謝途徑，通常經(jīng)JMT甲基化產(chǎn)生MeJA或者通過茉莉酸共軛合酶（JA conjugate synthase，JAR1）與氨基酸（如異亮氨酸）綴合，形成高生物活性的茉莉酸異亮氨酸共軛物（jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile）[8］。茉莉酸及其衍生物是擬南芥[9］和番茄[10］花發(fā)育的最后階段所必需的，STITZ等[11］對煙草開花的研究中也發(fā)現(xiàn)茉莉酸及其衍生物對開花起調(diào)控作用，JMT可以通過調(diào)節(jié)茉莉酸相關代謝物的水平參與此過程。SEO等[4］從擬南芥中克隆獲得AtJMT，發(fā)現(xiàn)過表達AtJMT增強了擬南芥對灰霉病菌的抗性。WU等[12］研究發(fā)現(xiàn)，MeJA處理引發(fā)的抗性不是由MeJA直接引起，而是由其去甲基化產(chǎn)物 JA所引起。STITZ等[13］在煙草中過表達AtJMT并沉默了煙草甲基茉莉酯酶基因（methyl jasmonate esterase，MJE），發(fā)現(xiàn)在傷口處理后，這種突變體（35S-jmt/ir-mje）未能出現(xiàn)和野生型一樣的JA，JA-Ile的上調(diào)，而是被一系列內(nèi)源性MeJA取代，結果導致在總茉莉酸（Jas）水平?jīng)]有差異的情況下，蘇氨酸脫氨酶和胰蛋白酶抑制劑（2種JA誘導的防御基因）的表達均顯著降低。QI等[14］對水稻OsJMT的研究發(fā)現(xiàn)，OsJMT通過介導JA和相關代謝物的水平，在水稻的生長和防御中起作用，MeJA可能是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育而非防御的信號，而 JA和其他信號，如JA-Ile可能主要介導防御。并且發(fā)現(xiàn)過表達OsJMT會顯著降低穗長、每穗穎花數(shù)和結實率，導致單株產(chǎn)量減少，但千粒重有所提高。在過去對JMT的研究報道中，過表達JMT通常會導致植物種子減產(chǎn)。如在擬南芥中，CIPOLLINI等[15］過表達AtJMT導致擬南芥種子重量和數(shù)量的減少。KIM等[16］在水稻中過表達AtJMT，也導致了谷粒產(chǎn)量和幼苗高度的降低。但有趣的是，過表達JMT卻會使塊莖類作物增產(chǎn)，如SOHN等[17］在馬鈴薯中過表達AtJMT，導致馬鈴薯的塊莖產(chǎn)量和大小的增加，并且JMT的表達水平越高，塊莖的產(chǎn)量也越高。而KIM等[18］在人參中過表達AtJMT也導致人參根系生長和人參皂苷異質(zhì)性的刺激。NAM 等[19］對過表達AtJMT大豆種子進行評估，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆的各成分均在商業(yè)上可獲得的大豆參考范圍內(nèi)，從而證明了這些轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆種子的實質(zhì)等同性。以上研究表明，JMT可能間接參與植物防御反應以及在種子和塊莖發(fā)育過程中起著重要作用，且具有一定的商業(yè)應用前景。【本研究切入點】紫蘇含有豐富的MeJA合成前體α-亞麻酸，是研究α-亞麻酸代謝途徑中JMT功能較好的植物[20-21］。之前均是對JMT在植物防御中作用的研究，而關于JMT在種子發(fā)育中的研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本文通過對紫蘇各組織包括不同發(fā)育時期種子中JMT表達的研究，揭示PfJMT在紫蘇種子發(fā)育中的表達模式。并使用外源MeJA和SA處理植物，研究PfJM在不同脅迫中的表達模式。為解決過表達JMT對植物種子產(chǎn)量的影響提供參考，驗證JMT在植物防御反應中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

紫蘇種子由重慶師范大學油用牡丹種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室保存。大腸桿菌DH5α、Premix Taq酶、DL2000Maker、T/A克隆載體pGEM-T、T4 DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于TaKaRa公司。EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（DNaseⅠ）購于北京博邁德公司。熒光定量試劑盒購于成都百樂公司。

2018年4月將紫蘇種子播種于重慶師范大學生命科學學院實驗基地，取開花期的根、莖、葉、花等組織，并取開花后5、10、15、20、25和30 d的種子，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?018年 7月，用 25μmol·L-1MeJA[22］和 1 mmol·L-1SA[23］噴灑處理種植于花盆中具有4片真葉的紫蘇幼苗，并澆灌根部，分別取處理0、2、4、8、16、24和48 h后的紫蘇根、葉組織，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PfJMT的克隆

采用 CTAB法提取紫蘇種子 DNA，利用植物總RNA試劑盒提取紫蘇各組織 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆茫ㄋ胁僮鞫紘栏癜凑照f明書進行）。根據(jù)紫蘇種子轉(zhuǎn)錄組測序結果[24］，設計PfJMT引物（PfJMT-F：5′-ATGGAAGTAGTACAAGTACT-3′，PfJMT-R：5′-TTATCTCCTGGTCAACGAAACG-3′）。分別以紫蘇DNA和種子cDNA為模板進行PCR擴增，將膠回收產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性單克隆測序。引物合成和測序均由英濰捷基有限公司完成。

1.3 PfJMT的生物信息學分析

利用NCBI在線工具BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對PfJMT的氨基酸序列進行比對分析。使用 Vector NTI系列軟件進行序列分析，查找ORF、翻譯成氨基酸序列等。使用 ExPASy（https://www.expasy.org/）分析PfJMT蛋白的分子量、等電點pI、疏水性等。用 SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽，用 TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）分析跨膜區(qū)，利用 Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）預測亞細胞定位。使用CDD（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi）分析其保守結構域。使用軟件DNAMAN進行多序列比對分析。采用鄰接法，利用MEGA7.0軟件對不同物種的JMT蛋白構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 PfJMT的表達分析

根據(jù)已克隆獲得的紫蘇PfJMT的ORF序列，設計qRT-PCR引物（PfJMT-RT-F：5′-CAACGTGGCGAA ATGCATGA-3′，PfJMT-RT-R：5′-TCTCCTGGTCAA CGAAACGG-3′），擴增產(chǎn)物大小為166 bp。分別以紫蘇各組織cDNA為模版，以紫蘇18S為內(nèi)參（18S-F：5′-CGGCGACGCATTCAAA-3′，18S-R：5′-GCTGCCT TCCTTGGATGTGG-3′）。qRT-PCR檢測PfJMT在不同組織器官中的表達水平，重復 3次。試驗結果用SPSS 13軟件進行統(tǒng)計分析，當P＜0.05時，統(tǒng)計結果具有統(tǒng)計學意義。柱形圖用Origin7.0進行繪制。

2 結果

2.1 PfJMT的克隆和生物信息學分析

在紫蘇種子轉(zhuǎn)錄組測序結果中發(fā)現(xiàn)一個紫蘇JMT，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該序列具有完整的ORF。根據(jù)紫蘇JMT序列設計引物，分別以紫蘇DNA和種子cDNA為模板，克隆獲得紫蘇JMT序列，將其命名為PfJMT（圖1-A）。PfJMT具有3個外顯子和2個內(nèi)含子（圖1-B），ORF為1 050 bp，編碼349個氨基酸。PfJMT預測蛋白分子量為39.4 kD，pI為5.79，帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）為 43個，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）為 36個，不穩(wěn)定系數(shù)為 53.95，屬于不穩(wěn)定蛋白。平均親水性（GRAVY）為-0.137，屬于親水性蛋白。預測PfJMT蛋白無信號肽，無跨膜域，定位于細胞質(zhì)。PfJMT含有一個甲基轉(zhuǎn)移酶-7（Methyltransf-7）結構域（圖1-C）。

圖1 PfJMT的克隆與分析Fig. 1 Cloning and analysis of the PfJMT

2.2 PfJMT的聚類分析

通過比對紫蘇、棉花Gossypium hirsutum（AJQ31847.1）、可可Theobroma cacao（EOY14822.1）、蓖麻Ricinus communis（XP 002510424.1）、擬南芥Arabidopsis thaliana（AEE29876.1）、向日葵Helianthus annuus（OTG00826.1）、青蒿Artemisia annua（AIN76708.1）、建蘭Cymbidium ensifolium（AFH89623.1）、丹參Salvia miltiorrhiza（APC65704.1）、蒺藜苜蓿Medicago truncatula（XP 003638267.1）和水稻Oryza sativa Japonica Group（XP_015639512.1）的JMT序列。發(fā)現(xiàn)PfJMT與丹參的氨基酸序列相似度最高，為80.5%；與水稻的序列相似度最低，為36.8%（表1）。使用DNAMAN對其中5個物種的JMT進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)1個保守基序的部分位置用方框標注（圖2），這段基序存在于甲基轉(zhuǎn)移酶-7結構域中，可能與JMT的功能密切相關。

使用DNAMAN對其中5個物種的JMT進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)1個保守基序的部分位置用方框標注（圖2），這段基序存在于甲基轉(zhuǎn)移酶-7結構域中，可能與JMT的功能密切相關。

2.3 PfJMT與其他物種的系統(tǒng)進化樹分析

使用MEGA7.0對這11個物種的JMT構建進化樹（圖 3），發(fā)現(xiàn)紫蘇和丹參親緣關系最近，其次與棉花、可可、蓖麻、擬南芥等雙子葉植物親緣關系較近，與建蘭和水稻2個單子葉植物的親緣關系較遠。表明 JMT在單子葉和雙子葉植物的進化過程中可能存在較大的差異。

2.4 PfJMT的實時熒光定量分析

通過對紫蘇不同組織和不同處理中PfJMT的qRT-PCR分析，結果表明PfJMT在紫蘇各組織中均有表達。其中，根和莖中的相對表達量最低，葉和花中的表達量比根和莖中略高，幼嫩種子中的表達量最高。在不同發(fā)育時期的種子中，開花后5 d的種子表達量最高，且隨著種子的發(fā)育，PfJMT的表達量逐漸下調(diào)（圖4）。在用外源MeJA、SA處理后的紫蘇根、葉中，PfJMT的表達和對照相比，均顯著下調(diào)（圖5）。

圖2 不同植物JMT的多序列比對分析Fig. 2 Multiple sequence alignment analysis of different plant JMT

表1 不同植物JMT蛋白一致率Table 1 Protein identities of JMT in different plants (%)

圖3 不同植物基于JMT氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of different plants based on amino acid of JMT

圖4 PfJMT在不同組織和種子不同發(fā)育時期的相對表達量Fig. 4 The relative expression of PfJMT in different tissues and seeds at different developmental stages

圖5 MeJA和SA處理對PfJMT表達的影響Fig. 5 Effect of MeJA and SA treatment on PfJMT expression

3 討論

3.1 JMT在不同植物中的保守性較低

本試驗根據(jù)紫蘇種子轉(zhuǎn)錄組測序結果設計引物克隆獲得PfJMT。生物信息學分析表明，PfJMT蛋白由349個氨基酸組成，pI為5.79，屬于不穩(wěn)定的親水蛋白，定位于細胞質(zhì)，與水稻、棉花JMT的亞細胞定位一致[14,25］。保守功能結構域分析發(fā)現(xiàn)，PfJMT含有一個甲基轉(zhuǎn)移酶-7結構域，是一種依賴S-腺苷-蛋氨酸（S-adenosyladenyl-L-methionine，SAM）的甲基轉(zhuǎn)移酶，屬于SABATH甲基轉(zhuǎn)移酶家族[26-27］。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，JMT在不同植物中序列差異較大（表 1）。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，來自單子葉植物和雙子葉植物的JMT親緣關系較遠。因此，來自不同植物的JMT在功能上保守，在序列上不保守。

3.2 JTM主要在植物發(fā)育而非防御反應中發(fā)揮作用

組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，PfJMT在紫蘇開花期各組織中均有表達，在花和葉中的相對表達量高于根和莖，在開花后5 d的種子中具有最高的表達量，并且隨著種子的發(fā)育表達量逐漸降低，這與轉(zhuǎn)錄組測序的結果相一致[24］。而在擬南芥中，AtJMT只在蓮座葉、莖生葉和花中表達，而在根、莖、角果中不表達[4］。

茉莉酸途徑和水楊酸途徑在植物防御反應中發(fā)揮著重要的作用，通常JA途徑主要介導對食草動物以及壞死性病原體的抗性，SA途徑主要介導對生物營養(yǎng)型病原體的抗性[28-30］。JA途徑和SA途徑存在拮抗作用，這是植物長期在各種生物和非生物脅迫中，為了生存而精確分配有限的資源來適應環(huán)境的結果[31］。先前研究證明了 MeJA處理引起的抗性不是由MeJA直接引起的，而是由其去甲基化產(chǎn)物JA引起的[12］。本研究在使用外源MeJA和SA處理后的紫蘇葉和根中，發(fā)現(xiàn)JMT表達均顯著下調(diào)，該結果與 MeJA不直接參與防御反應的理論相符，但不同于使用SA處理導致水稻OsJMT表達既有上調(diào)又有下調(diào)的結果，這可能是由于我們使用過量的 MeJA和SA處理所致。MeJA處理后JMT表達下調(diào)可能是一種反饋調(diào)節(jié)，也可能是MeJA作為一種信號分子，在接受到這種信號后，植物為了響應JA途徑而下調(diào)JMT的表達，并將MeJA去甲基化形成JA參與到后續(xù)的防御反應中。而SA處理，抑制了JA途徑，JMT的表達也隨之降低。以上結果表明，JMT主要在植物發(fā)育（如種子發(fā)育）中發(fā)揮重要作用，而非防御反應。

3.3 JMT在基因工程中的應用

有研究表明，過表達JMT通常會使植物的抗性有所提高，這是由于過表達JMT會導致茉莉酮酸酯水平上升而不影響茉莉酮酸水平的結果[4］。雖然過表達JMT會使塊莖類作物的產(chǎn)量提升，但會造成種子類作物產(chǎn)量的降低。在水稻中，過表達AtJMT導致MeJA積累水平增加，介導了脅迫信號導致ABA水平上升，影響了水稻穗的分化，最終導致產(chǎn)量降低[16］。并且，利用水稻自身的JMT在水稻中過表達，也出現(xiàn)了類似情況[14］。本研究發(fā)現(xiàn)，PfJMT在種子發(fā)育過程中呈現(xiàn)出逐漸降低的表達模式，因此過表達JMT除了會對穗分化產(chǎn)生不良影響，還可能對種子的發(fā)育本身帶來不利的結果，要將JMT用于改良種子類作物具有較高的難度，但由于過表達JMT會使塊莖類作物增加，因此將JMT用于改良塊莖類作物將會是簡單有效的。

4 結論

從紫蘇中克隆得到PfJMT的ORF，編碼349個氨基酸，該氨基酸序列具有一個甲基轉(zhuǎn)移酶-7結構域，與擬南芥、丹參等雙子葉植物親緣關系較近，而與建蘭、水稻等單子葉植物親緣關系較遠。PfJMT在開花后5d的種子中表達量最高，并隨著種子的發(fā)育表達量逐漸降低。外源MeJA和SA處理，均導致PfJMT的表達量顯著下調(diào)。