結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

羅 風(fēng)，李曉非，丁彩梅

(昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明650041)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)復(fù)合群為結(jié)核病的病原菌，導(dǎo)致人患肺結(jié)核的致病菌90%以上為MTB，該菌主要通過飛沫傳播，通過消化道及損傷皮膚等途徑感染機(jī)體也偶有報道[1]。結(jié)核病的致死率高于獲得性免疫缺陷綜合征，在全世界范圍內(nèi)其病死率居傳染性疾病排行榜第一位，據(jù)統(tǒng)計2016年全球估計有1 040萬新發(fā)結(jié)核病患者，10%為新患結(jié)核病的兒童，130萬結(jié)核病患者死亡，其中20萬兒童結(jié)核病患者死亡,且兒童結(jié)核病大部分是由患活動性肺結(jié)核的成人患者傳染而得；同時提出我國耐多藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)居世界第二位，2016年耐藥結(jié)核病占新增結(jié)核病的4.1%[2-5]。當(dāng)前我國結(jié)核病防治現(xiàn)狀形勢嚴(yán)峻，結(jié)核病患病人口基數(shù)大，病例發(fā)現(xiàn)率低，常被誤診及延遲治療，主要是由于臨床上缺乏針對結(jié)核病準(zhǔn)確、快速、簡便的實(shí)驗(yàn)室檢測及病情監(jiān)測技術(shù)[5-9]?，F(xiàn)對近年來國內(nèi)外各項(xiàng)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床應(yīng)用范圍進(jìn)行歸納，總結(jié)該領(lǐng)域當(dāng)前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，以期為臨床結(jié)核病早期精準(zhǔn)診治及病情監(jiān)測探索更實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)。

1 細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)

結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為MTB細(xì)菌學(xué)檢查陽性；MTB細(xì)菌學(xué)檢查方法包括細(xì)菌涂片顯微鏡檢測技術(shù)和細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)，由于其細(xì)菌學(xué)檢查的陽性檢出率不高，導(dǎo)致臨床上結(jié)核病診斷出現(xiàn)大量的漏診及誤診現(xiàn)象[2]。

1.1標(biāo)本涂片方法 由于傳統(tǒng)的直接涂片法不容易檢出MTB，臨床工作者不斷進(jìn)行各種濃縮集菌涂片法的嘗試，以期提高M(jìn)TB的檢出率[10]。一項(xiàng)研究收集864份痰標(biāo)本同時進(jìn)行夾層杯離心集菌涂片法和傳統(tǒng)涂片法檢測MTB，結(jié)果前者檢測的陽性率較后者高11.92%，且前者操作簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化，說明前者是一種優(yōu)于傳統(tǒng)涂片法的檢測方法[11]。李淑敏等[12]提出改良抗酸染色法與傳統(tǒng)抗酸染色法相比檢出率提高到88.57%，同時改良法可以檢測到胞內(nèi)桿菌；改良法是將傳統(tǒng)法的試管離心改為玻片離心，然后triton破膜后行抗酸染色。李雪蓮和高孟秋[13]提出應(yīng)用玻片離心改良抗酸染色法，可將傳統(tǒng)方法的檢出率提高至61.7%。以上方法有效提高了涂片查找MTB的檢出率。

1.2齊-尼(Ziehl-Neelsen)染色鏡檢法 Ziehl-Neelsen是目前國內(nèi)外常用的抗酸染色法，染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察MTB菌體呈紅色，背景呈藍(lán)色。該法是臨床上確診肺結(jié)核的可靠方法，是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的結(jié)核病診斷方法之一，具有簡單、快速和可靠等優(yōu)點(diǎn)；該法的缺點(diǎn)是欠敏感，不能區(qū)分MTB與非MTB(欠特異)，在疾病的不同階段診斷敏感性不同，無法分辨死菌與活菌，易受標(biāo)本質(zhì)量及檢驗(yàn)人員技術(shù)水平的影響，結(jié)果陰性也不能排除結(jié)核病[7]。

1.3發(fā)光二極管熒光顯微鏡鏡檢法 發(fā)光二極管熒光顯微鏡鏡檢法是在熒光染色鏡檢法的基礎(chǔ)上應(yīng)運(yùn)而生的，是繼傳統(tǒng)顯微鏡檢查后的一大突破。WHO已推薦其逐步取代傳統(tǒng)熒光顯微鏡，同時作為傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的替代技術(shù)[14]。與傳統(tǒng)顯微鏡相比，發(fā)光二極管熒光顯微鏡更持久耐用，鏡光柔和成本低，光路調(diào)節(jié)簡單，不需要暗室環(huán)境同時極大提高了檢測敏感性，同時其對檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平要求不高，基層醫(yī)院人員只要經(jīng)過培訓(xùn)熟練掌握后即可開展工作，目前該方法已在發(fā)達(dá)國家普遍推廣[15-17]。但是發(fā)光二極管熒光顯微鏡檢測MTB也存在與傳統(tǒng)檢測方法相同的弊端，即其無法區(qū)分MTB和非MTB、死菌和活菌。在發(fā)光二極管熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上又出現(xiàn)了自動化數(shù)字顯微圖像結(jié)核病檢測技術(shù)系統(tǒng)，它是一種可以自動處理熒光顯微圖像以識別MTB同時報告檢測結(jié)果的新技術(shù)，該系統(tǒng)可以提高對活動性結(jié)核病診斷的敏感性和特異性，其性能相當(dāng)于一個經(jīng)驗(yàn)豐富的MTB檢驗(yàn)醫(yī)師，缺點(diǎn)是有時仍需要人工閱片復(fù)檢[18-19]。

2 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

盡管當(dāng)前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)不斷進(jìn)步，對調(diào)查結(jié)核病發(fā)病機(jī)制非常有利，但要分析這種緩慢生長病原體的基本基因功能以及為臨床提供快速準(zhǔn)確病原學(xué)檢測結(jié)果仍非常困難[20]。分子生物學(xué)檢測技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢正迅猛發(fā)展且逐步取代傳統(tǒng)的MTB檢測技術(shù)[21]。

2.1基因編輯技術(shù)——規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列干擾技術(shù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-interference，CRISPRi) CRISPRi技術(shù)自問世以來，在編輯真核和原核生物基因方面發(fā)揮著極大作用，同時成為研究MTB基因功能的新工具，有望成為一種穩(wěn)定、易于設(shè)計和可擴(kuò)展的調(diào)節(jié)基因沉默的平臺[22]。CRISPRi系統(tǒng)抑制生物細(xì)胞靶基因表達(dá)的原因是Cas9-引導(dǎo)RNA復(fù)合體同與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)的DNA結(jié)合，導(dǎo)致空間位阻的產(chǎn)生，以致終止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，最終結(jié)果是抑制靶基因的表達(dá)[23]。Choudhary等[24]在2015年成功構(gòu)建了CRISPRi系統(tǒng)，該系統(tǒng)能高效抑制MTB基因表達(dá)；Singh等[25]在2016年成功運(yùn)用CRISPRi系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對MTB幾個功能基因的表達(dá)抑制。由于CRISPRi系統(tǒng)中化膿性鏈球菌Cas9在MTB中較低的基因敲除效率和蛋白毒性，Rock等[26]對此問題進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌Cas9的CRISPRi系統(tǒng)蛋白毒性最小同時其基因調(diào)控更精準(zhǔn)。CRISPRi系統(tǒng)可用于MTB不同生長階段，且能對多個功能基因同時進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，是一種高效率、廣泛適用的基因編輯技術(shù)，期待該系統(tǒng)在MTB功能基因組學(xué)、遺傳相互作用和藥物靶標(biāo)分析等方面發(fā)揮更大的作用[27]。

2.2利福平耐藥實(shí)時熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù) MTB利福平耐藥實(shí)時熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(GeneXpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，GeneXpert MTB/RIF)是近年來MTB分子診斷方面的突破之一，是由Cepheid公司研發(fā)的全自動半定量巢式實(shí)時熒光定量檢測技術(shù)，包括Xpert MTB/RIF檢測試劑盒及“GeneXpert”聚合酶鏈反應(yīng)平臺，適用儀器為GeneXpert；該技術(shù)可從待測標(biāo)本中檢測出MTB復(fù)合群同時判斷其耐藥性(僅針對利福平)，引物和探針是依據(jù)單拷貝基因rpoB耐藥決定區(qū)而設(shè)計，對操作人員的技術(shù)水平要求低，整個檢測過程安全無污染在密閉環(huán)境進(jìn)行，2 h即可出結(jié)果[28-29]。2016年Gürsoy等[30]為評價Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)在臨床樣本中檢測MTB的診斷性能，采用Xpert MTB/RIF試驗(yàn)方法對2 160份標(biāo)本(肺內(nèi)標(biāo)本1 141份，肺外標(biāo)本1 019份)進(jìn)行測試，結(jié)果顯示其檢測對于肺外標(biāo)本、肺內(nèi)標(biāo)本及全部標(biāo)本的靈敏度分別為63.9%、77.5%、73.3%，特異度分別為99.2%、99.5%、99.3%。該研究說明Xpert MTB/RIF技術(shù)對所有樣本檢測的特異度較高，雖然對肺外樣本的敏感性處于中等水平，但也提示其對肺外結(jié)核的快速診斷有一定價值。余麗等[31]對Xpert MTB/RIF技術(shù)診斷MTB進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其有很高的準(zhǔn)確度，這與Gürsoy等[30]研究結(jié)果一致，同時該團(tuán)隊(duì)采用梯度濃度稀釋法得出Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測MTB的最低檢出限達(dá)300 CFU/mL，該數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法基本相似，且得出在檢測樣本中MTB含量低于300 CFU/mL時，易出現(xiàn)利福平耐藥假陽性的結(jié)果。由于兒童難以提供呼吸道標(biāo)本，Banada等[32]利用Xpert MTB/RIF技術(shù)對南非班德地區(qū)40例(20例已確診肺結(jié)核、20例為健康對照)兒童糞便進(jìn)行MTB檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)取0.6 g和1.2 g糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測的靈敏度分別為85%和84%，特異度分別為100%和94%。以上研究說明Xpert MTB/RIF的檢測結(jié)果會受到標(biāo)本類型及標(biāo)本量的影響，同時也說明該方法對兒童結(jié)核病的診斷也較為理想，另有研究報道該方法在排除疑似結(jié)核病患者方面有極大的診斷價值[33]。由于其能在快速準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病的同時檢測MTB的利福平耐藥性，WHO將Xpert MTB/RIF技術(shù)替代傳統(tǒng)MTB檢測技術(shù)作為診斷兒童肺結(jié)核、結(jié)核病/HIV雙重感染患者的首選檢測方法[34]。

2.3環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification,LAMP) LAMP是以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，該技術(shù)克服了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)需要熱循環(huán)設(shè)備價格高以及對操作人員技術(shù)要求高等缺點(diǎn)，同時該技術(shù)采用4個MTB特異性引物以識別目標(biāo)DNA上的6個不同的特異性區(qū)域以縮短反應(yīng)時間并提高反應(yīng)的特異度及靈敏度[13，35]。Bojang等[36]分別采用LAMP、細(xì)菌培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF 3種方法對來自岡比亞441例患者的痰標(biāo)本進(jìn)行MTB檢測同時對檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果以細(xì)菌培養(yǎng)為參考方法LAMP診斷結(jié)核病的總靈敏度為99%，特異度為94%，同時該研究得出LAMP和GeneXpert MTB/RIF有相似的高靈敏度及特異度。Yan等[37]對LAMP、同步擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)和Xpert MTB/RIF在以往實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)為參考方法診斷肺結(jié)核方面的研究中進(jìn)行了薈萃分析，發(fā)現(xiàn)LAMP診斷的靈敏度和特異度為93%和94%，同步擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)診斷的靈敏度和特異度為96%和88%，Xpert MTB/RIF診斷靈敏度和特異度為89%和98%。由以上研究可知LAMP實(shí)驗(yàn)過程中不需要熱循環(huán)儀器進(jìn)行DNA擴(kuò)增，具有快速、特異、靈敏和穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。LAMP也存在不足，由于該檢測法是針對MTB的DNA為靶序列設(shè)計引物同時進(jìn)行擴(kuò)增，對死菌也表現(xiàn)為陽性結(jié)果，因此該方法不能對臨床抗結(jié)核治療效果進(jìn)行監(jiān)測，且實(shí)驗(yàn)過程中DNA雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易降解[38-39]。

2.4逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(reverse transcription-LAMP,RT-LAMP) RT-LAMP的擴(kuò)增體系含逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和RNA模板，這是與LAMP技術(shù)的幾個不同之處[40]。由于16S rRNA為單鏈結(jié)構(gòu)且僅大量存在于代謝增殖的活MTB中，因此合并反轉(zhuǎn)錄功能RT-LAMP技術(shù)能在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高檢測靈敏度，同時還可以判定活菌[41-43]。吳丹丹等[40]為了比較RT-LAMP和LAMP檢測結(jié)核病的靈敏度和特異度，對122例患者(100例確診肺結(jié)核患者、22例非結(jié)核菌感染患者)的痰標(biāo)本分別采用RT-LAMP、LAMP、羅氏固體培養(yǎng)法進(jìn)行MTB檢測，以羅氏固體培養(yǎng)法進(jìn)行對比，結(jié)果顯示RT-LAMP在靈敏度和活菌檢測方面存在LAMP不可超越的優(yōu)勢。由于RT-LAMP有技術(shù)操作簡便同時可對臨床抗結(jié)核治療效果進(jìn)行評估等優(yōu)點(diǎn)，更適用于基層醫(yī)療單位使用。

2.5全基因組測序 隨著測序技術(shù)的成熟、測序成本的降低，全基因組測序已在MTB的研究中發(fā)揮了巨大作用[44-45]，該技術(shù)是采用高通量測序儀對微生物的基因組核酸測序，以獲取該細(xì)菌全部基因組DNA序列的方法。由于MTB自發(fā)突變率低，可以采用全基因組測序來分析菌株間單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)差異，然后通過SNP對MTB進(jìn)行菌種鑒定、判斷其傳播方向、分辨復(fù)發(fā)與再感染或混合感染[46-48]。說明該方法在MTB流行病學(xué)研究方面有不可取代的地位?，F(xiàn)有的耐藥分子檢測手段基本完成了利福平和異煙肼等一線抗結(jié)核藥物的耐藥診斷，而且其靈敏度和特異度可達(dá)90%以上[49]，但是目前已知的耐藥突變位點(diǎn)不能解釋所有表型耐藥，若使用全基因組測序技術(shù)對MTB的相關(guān)基因耐藥突變進(jìn)行檢測，則耐藥檢測就不再僅局限于幾種一線抗結(jié)核藥物，且該方法可以檢測出更多的MTB藥敏信息[50]。科學(xué)家們通過全基因組關(guān)聯(lián)性分析探討SNP與MTB表型之間的關(guān)系，Walker等[51]共收集3 000多株臨床分離株進(jìn)行全基因組測序及全基因組關(guān)聯(lián)性分析，最終沒有發(fā)現(xiàn)新的可靠耐藥突變位點(diǎn)，考慮可能與臨床菌株的遺傳背景差異大、耐藥機(jī)制復(fù)雜等有關(guān)。全基因組測序的優(yōu)點(diǎn)為可以更準(zhǔn)確、全面地診斷出MTB的菌種、基因突變位點(diǎn)及其耐藥信息等，缺點(diǎn)為依賴細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)、分析流程繁瑣、數(shù)據(jù)量大、現(xiàn)有研究結(jié)果異質(zhì)性大等[52]。Brown 等[53]曾嘗試脫離MTB細(xì)菌培養(yǎng)過程，將痰標(biāo)本直接進(jìn)行全基因組測序，并取得成功。盡管關(guān)于全基因組測序當(dāng)前還有很多問題尚未解決，但其憑借極高的正確度、檢測速度快等優(yōu)勢在發(fā)達(dá)國家已列入結(jié)核病常規(guī)診斷流程，在我國則多用于科學(xué)研究。

2.6基因芯片技術(shù) 在20世紀(jì)90年代初期，隨著生物化學(xué)、遺傳學(xué)等多學(xué)科交融發(fā)展以及多物種基因組測序的完成，DNA微陣列應(yīng)運(yùn)而生，即基因芯片技術(shù)?；蛐酒菍⒏鶕?jù)MTB全基因組中保守的功能基因序列和SNP位點(diǎn)而設(shè)計的探針固定在一定的載體上，再加入熒光標(biāo)記的待測樣本核酸，通過分析熒光雜交信號來進(jìn)行菌株鑒定，細(xì)菌基因分型，耐藥性分析等；當(dāng)前臨床常用的有基因檢測芯片，菌種分型芯片和耐藥檢測芯片等。王丹吉等[54]分別采用基因芯片技術(shù)，羅氏培養(yǎng)技術(shù)和傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)對1 297例肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行MTB異煙肼、利福平等耐藥性的檢測，以傳統(tǒng)藥敏方法為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測異煙肼的特異度和靈敏度分別為97.42%、81.91%，檢測利福平的特異度和靈敏度分別為98.18%、84.48%，結(jié)果說明基因芯片技術(shù)對于MTB耐藥性的檢測具有較高的靈敏度與特異度，非常適用于耐多藥結(jié)核病的早期診斷。但其檢出限達(dá)不到300 CFU/mL，說明敏感性不如GeneXpert MTB/RIF技術(shù)。許榕青等[55]研究結(jié)果提示以BACTEC MGIT960藥敏結(jié)果為參考，基因芯片技術(shù)對異煙肼耐藥性檢測表現(xiàn)出較低的敏感性，且對于利福平耐藥檢測基因芯片法與基因測序結(jié)果也不完全一致，說明基因芯片檢測的MTB基因位點(diǎn)范圍略窄。針對基因芯片檢測技術(shù)靈敏度不高這一問題，科研工作者應(yīng)考慮進(jìn)一步擴(kuò)大基因芯片檢測MTB基因位點(diǎn)范圍?？傊蛐酒夹g(shù)可以快速直接對痰標(biāo)本MTB進(jìn)行耐藥性檢測，檢測結(jié)果具備較好的特異度與靈敏度，可以為臨床結(jié)核病的診治提供快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)。

3 小 結(jié)

目前我國結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)已取得長足進(jìn)步，不少新的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)已在各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行推廣普及，新技術(shù)的應(yīng)用也提高了結(jié)核病的診斷率。但當(dāng)前用于結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測的技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，評價一種新技術(shù)的普適性需要大樣本、大范圍、多地區(qū)和多中心的臨床實(shí)踐來驗(yàn)證。為更好地解決以上問題，應(yīng)該從宏觀角度整合醫(yī)療衛(wèi)生資源，加強(qiáng)相關(guān)人員學(xué)習(xí)及應(yīng)用結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測新方法、新技術(shù)的認(rèn)知理念，逐步形成對新技術(shù)的驗(yàn)證、推廣機(jī)制，提高我國整體結(jié)核病防治工作服務(wù)水平，以期在臨床實(shí)踐中不斷對新技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新。相信通過各級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對新技術(shù)的合理運(yùn)用，我國臨床結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷水平將會出現(xiàn)質(zhì)的突破，從而更好地為臨床結(jié)核病精準(zhǔn)防治提供強(qiáng)力支持。