食醋抗氧化性比較分析

王雯婷， 宿友志, 馮治平， 許德富， 呂開斌， 賀曉英

(四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院， 四川自貢643000)

引言

食醋是一種酸性調(diào)味品，主要以大米、糯米、高粱、玉米、小米、水果等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分及功能因子，具有預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病、保護(hù)肝臟、抗衰老及美容護(hù)膚、防癌抗癌等保健功能，而這些功能都與食醋的抗氧化性緊密相關(guān)[1-3]。

人體中的過氧化脂質(zhì)會(huì)隨年齡的增加而不斷增加，而脂質(zhì)的過氧化被認(rèn)為與人體衰老、動(dòng)脈硬化和癌癥發(fā)生緊密相關(guān)[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)食醋對(duì)動(dòng)物機(jī)體中過氧化脂質(zhì)的形成有抑制作用，從而延緩機(jī)體的衰老，如給老鼠服用一種叫作惡性啉巴腺腫的物質(zhì)，能增加其體內(nèi)的過氧化脂質(zhì)，但若同時(shí)喂以米醋，則能減少過氧化脂質(zhì)的量，米醋的這種作用與其被攝入量有關(guān)[7]。Nishidai S等[8]發(fā)現(xiàn)一種叫Kurosu的傳統(tǒng)醋能增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤性，而這與其抗氧化特性相關(guān)。

閆霞、郝林[9]對(duì)不同生產(chǎn)階段及不同存放時(shí)間段的山西老陳醋進(jìn)行了總酚含量、總黃酮含量及DPPH自由基清除率的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)三者在醋酸發(fā)酵階段逐漸增加，熏醅時(shí)達(dá)到最高，陳醋抗氧化活性與其多酚濃度相關(guān)，另一方面隨著食醋存放時(shí)間的延長(zhǎng)，其中的抗氧化物質(zhì)含量有一定程度的減少。暢功民、毛立新[10]也對(duì)山西老陳醋的抗氧化性及其機(jī)理進(jìn)行過探究，發(fā)現(xiàn)50 μL、200 μL醋樣對(duì)DPPH自由基的清除能力分別為50.2%和68.7%，對(duì)亞油酸體系自氧化抑制率分別為69.7%和78.7%，而陽(yáng)性對(duì)照100 μg丁基羥基茴香醚(Butyl Hydroxy Anisd，BHA) 的DPPH自由基清除能力和亞油酸體系自氧化抑制率分別為69.8%和78.7%，說明山西老陳醋的抗氧化能力和清除DPPH自由基能力較強(qiáng)；此外，還發(fā)現(xiàn)山西老陳醋中多酚含量為4.865 mg/mL。

李云龍、何永吉等[11]以發(fā)芽萌動(dòng)后的苦蕎麥為主要原料，利用生料發(fā)酵結(jié)合傳統(tǒng)老陳醋工藝來制備萌動(dòng)苦蕎醋，對(duì)其功能活性物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，并采用DPPH法和鐵離子還原/抗氧化能力法(Ferric Ion Reducing Antioxidant Power，F(xiàn)RAP)評(píng)價(jià)抗氧化性能，研究發(fā)現(xiàn)萌動(dòng)苦蕎醋含有豐富的總黃酮、總酚、γ-氨基丁酸(GABA)和D-手相肌醇(D-CI)，其DPPH自由基清除率最高可達(dá)88.23%，總抗氧化值為54.54 FeSO4 mmol/L，具有良好的抗氧化活性。王志煌、唐敏敏等[12]采用液體發(fā)酵法制得椰棗果醋，探討了椰棗果醋對(duì)DPPH自由基、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-Azino-Bis(3-Bth-Ylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid，ABTS)自由基的清除力和對(duì)三價(jià)鐵離子的還原力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除率為97%，ABTS+自由基清除率為92%，說明椰棗果醋擁有良好的抗氧化活性，具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，此外還發(fā)現(xiàn)其總酚含量為1.437 mg/mL,總酸含量為8.628 g/100 g。

但上述這些研究都以一種或少數(shù)幾種食醋為對(duì)象，研究結(jié)果受到特定處理環(huán)境的限制，相互之間也不能形成可比性，因此對(duì)消費(fèi)選擇所起的指導(dǎo)作用不大，此外，對(duì)食醋的抗氧化性機(jī)理方面的研究也不夠深入。鑒于此，本研究從超市收集多個(gè)品種的食醋，對(duì)其抗氧化能力(包括還原力和DPPH自由基清除率)進(jìn)行分析比較，檢測(cè)其總酚和總黃酮含量，并對(duì)抗氧化性與總酚、總黃酮含量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，探討抗氧化性機(jī)理，以期為人們的消費(fèi)作出指導(dǎo)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從市場(chǎng)上選擇了19種具有代表性的食醋樣品，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品

注：(1)除17#為配制醋外，其余皆為釀造醋；(2)a為濃色醋，其余為白醋。

1.2 主要試劑和儀器

試劑：沒食子酸(上海金穗生物科技有限公司，純度(UV)=98%)；蘆丁(上海金穗生物科技有限公司，純度(UV)≥98%)；福林-酚試劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、1.1-二苯基-2-苦基肼基自由基(1.1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl Radical，DPPH)等，均為分析純，產(chǎn)自成都市科龍化工試劑廠。

儀器：電熱恒溫水浴鍋(ES-3620K，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(UV1000，天美控股科學(xué)有限公司)，臺(tái)式低速離心機(jī)(TD-5，四川蜀科儀器有限公司)，電子天平(FA2204N，成都一科設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1抗氧化性評(píng)價(jià)

通過測(cè)定食醋的還原力和DPPH自由基清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化性[13-14]。

(1)還原力的測(cè)定：普魯士藍(lán)法

取1 mL稀釋50倍的醋樣于10 mL具塞比色管中，加入2.5 mL磷酸緩沖液和2.5 mL鐵氰化鉀(1 g/100 mL)，充分震蕩混勻， 50 ℃下水浴20 min，取出，加入2.5 mL三氯乙酸(10 g/100 mL)，于3000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液于10 mL具塞試管中，加2.5 mL蒸餾水、1 mL三氯化鐵(0.1 g/100 mL)，于700 nm下測(cè)吸光度，同時(shí)作空白對(duì)照，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，取平均值。吸光值越大代表還原能力越強(qiáng)。

(2)DPPH自由基清除率的的測(cè)定

取醋樣1mL于具塞試管中，再加等體積的 DPPH溶液(0.2 mmol/L)，搖勻，靜置30 min，用無水乙醇作參比測(cè)定其吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定DPPH 溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測(cè)液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Aj。測(cè)定波長(zhǎng)為517 nm，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，取平均值。根據(jù)下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

清除率= [ 1- (Ai-Aj) /AC]×100%

1.3.2總黃酮的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法檢測(cè)食醋中的總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品[13]。

(1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次移取0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL和3.5 mL，分別置于10 mL比色管中，加入0.5 mL亞硝酸鈉溶液(5%)，混勻，放置6 min，加入0.5 mL硝酸鋁溶液(10%)，搖勻，放置6 min，加入4 mL氫氧化鈉溶液(5%)，用乙醇溶液(30%)定容至刻度，搖勻，靜置15 min，在510 nm下測(cè)試吸光值，以不含蘆丁的空白溶液為參比，然后以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

(2)樣品液中總黃酮的測(cè)定

取0.2 mL稀釋十倍的醋樣于10 mL比色管中，按照(1)的方法測(cè)定吸光度，以不加樣品的空白反應(yīng)液為參比，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。將吸光度代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程來計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

1.3.3總酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定醋樣中總酚的含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品[16]。

(1)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制 20 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次移取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL和6.0 mL于10 mL具塞比色管中，依次加入1.0 mL經(jīng)稀釋10倍的福林-酚試劑和3.0 mL碳酸鈉溶液(7.5%)，用蒸餾水定容至 10 mL，搖勻，30 ℃下靜置 1小時(shí)，在波長(zhǎng) 765 nm 處測(cè)定吸光值，不含沒食子酸的空白溶液為參比。以吸光值為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

(2)樣品液中總酚的測(cè)定

移取0.2 mL稀釋10倍的醋樣于10 mL比色管中，按照(1)的方法測(cè)定吸光度，以不含樣品的空白反應(yīng)溶液為參比，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。將吸光度代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程來計(jì)算總酚含量。

1.3.4相關(guān)性分析

運(yùn)用Microsoft Excel軟件，分析食醋總黃酮、總酚含量與還原能力和DPPH自由基清除率的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 食醋抗氧化性分析

(1)還原力

用普魯士藍(lán)法測(cè)定各個(gè)食醋的還原能力，反應(yīng)中生成的普魯士藍(lán)在700 nm處有最大吸光值，吸光值越大代表樣品的還原能力越強(qiáng)，結(jié)果見表2。

表2 普魯士藍(lán)法測(cè)定食醋的還原力(以吸光值表示)

從表2可知，食醋還原能力由大到小排名前5位的依次為：10#(F牌香醋)、6#(B牌十年陳醋)、5#(B牌五年陳醋)、4#(B牌三年陳醋)和7#(C牌陳醋)，它們皆為濃色醋，其中10#的還原力最大，為0.898，其次為6#，還原力為0.862；白醋的還原力普遍較小，15#(C牌白醋)的還原力在白醋中是最大的，為0.122，18#(E牌白醋)的還原力最小，只有0.042。

2.1.2食醋DPPH自由基清除率

DPPH醇溶液呈紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收，但當(dāng)加入抗氧化劑時(shí)，顏色逐漸減褪，因而可用分光光度計(jì)對(duì)抗氧化劑的DPPH自由基清除率進(jìn)行快速的定量分析。各食醋對(duì)DPPH自由基清的清除率見表3。

表3 食醋DPPH自由基清除率

從表3可知，食醋DPPH自由基的清除率由大到小排名前5位的依次為：10#(F牌香醋)、6#(B牌十年陳醋)、5#(B牌五年陳醋)、4#(B牌三年陳醋)和7#(C牌陳醋)，它們皆為濃色醋，其中10#的DPPH自由基清除率最高，為98.05%，其次為6#，自由基清除率為94.29%，以上排名順序與還原力的研究一致；與濃色醋相比，白醋的DPPH自由基清除率皆較小，這一點(diǎn)也與還原力的研究一致。

對(duì)19種食醋的還原能力的和DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果說明不同品牌食醋之間、同一品牌內(nèi)不同品種之間、濃色醋和白醋之間的抗氧化力都存在明顯的差異，F(xiàn)牌香醋和B牌十年陳醋具有較強(qiáng)的抗氧化性，濃色醋抗氧化性明顯強(qiáng)于白醋。

2.2 食醋抗氧化性機(jī)理的研究

為了進(jìn)一步探究食醋抗氧化性機(jī)理，分別對(duì)其總酚含量與總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，研究這兩種物質(zhì)與食醋抗氧化性的相關(guān)性。

2.2.1食醋中總黃酮的測(cè)定

(1)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，如圖1 所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1 可知，蘆丁濃度在5 μg/mL～35 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.01025x-0.00033，相關(guān)系數(shù)R=0.99980。

(2)樣品中總黃酮的測(cè)定

將食醋樣品的吸光值帶進(jìn)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.01025x-0.00033來計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表4。

表4 食醋的總黃酮含量

從表4可知，19個(gè)食醋樣品中，6#(B牌10年陳醋)和10#(F牌香醋)的總黃酮含量相對(duì)較高，分別為1.8592 mg/mL和1.7373 mg/mL。同一品牌中，如A牌的一年陳醋(1#)、3年陳醋(2#)和5年陳醋(3#)，其總黃酮含量依次為0.9962 mg/mL、1.1766 mg/mL和1.1376 mg/mL，其中一年陳醋為濃色醋中最低者；白醋中總黃酮含量最高的是17#即E牌白醋(配制)，為0.3722 mg/mL，說明白醋的總黃酮含量普遍低于濃色醋。

2.2.2食醋總酚含量的測(cè)定

(1)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光值為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，如圖2 所示。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖2 可知，沒食子酸在1 μg/mL～6 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.17411x+0.01111，相關(guān)系數(shù)R=0.99965。

(2)樣品中總酚含量的測(cè)定

將食醋樣品的吸光值帶進(jìn)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.17411x+0.01111來計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表5。

表5 食醋的總酚含量

從表5可知，19個(gè)食醋樣品中，10#(F牌香醋)和6#(B牌10年陳醋)的總酚含量相對(duì)較高，分別為3.1356 mg/mL和2.9518mg/mL；1#(A牌一年陳釀)的總酚含量為1.9352 mg/mL，為濃色醋中最低的。白醋中，14#(B牌白醋)總酚含量最高，為0.6171 mg/mL，說明白醋的總酚含量普遍低于濃色醋。

2.2.3相關(guān)性分析

(1)DPPH自由基清除率與總酚含量的相關(guān)性分析

食醋DPPH自由基清除率與總酚含量的相關(guān)性如圖3所示。

圖3 DPPH自由基清除率與總酚含量的相關(guān)性

從圖3 可知，DPPH自由基清除率與總酚含量的相關(guān)性方程為y=35.014x-1.0304，相關(guān)系數(shù)R=0.98918，說明DPPH自由基清除率與總酚含量相關(guān)性較高。上述發(fā)現(xiàn)與徐清萍等[5]的研究基本吻合，他們發(fā)現(xiàn)恒順香醋乙酸乙酯萃取物具有自由基清除活性，而相關(guān)活性成分之一即為酚性化合物。

(2)DPPH自由基清除率與總黃酮含量的相關(guān)分析

食醋DPPH自由基清除率與總黃酮含量的相關(guān)性如圖4所示。

圖4 DPPH自由基清除率與總黃酮含量的相關(guān)性

從圖4 可知，DPPH自由基清除率與總黃酮含量的相關(guān)性方程為y=65.217x-1.8523，相關(guān)系數(shù)R=0.95450，說明DPPH自由基清除率與總黃酮含量相關(guān)性較高。

(3)還原力與總酚含量的相關(guān)性分析

食醋還原力與總酚含量的相關(guān)性如圖5所示。

圖5 還原力與總酚含量的相關(guān)性

從圖5 可知，食醋還原力與總酚含量的相關(guān)性方程為y=0.27665x-0.02581，相關(guān)系數(shù)R=0.98259，說明食醋還原力與總酚含量相關(guān)性高。

(4)還原力與總黃酮含量的相關(guān)性分析

食醋還原力與總黃酮含量的相關(guān)性如圖6 所示。

圖6 還原力與總黃酮含量的相關(guān)性

從圖6 可知，食醋還原力與總黃酮含量的相關(guān)性方程為y=0.52009x-0.03679，相關(guān)系數(shù)R=0.95700，說明食醋還原力與總黃酮含量的相關(guān)性較高。

綜上結(jié)果，說明食醋的抗氧化性與其總酚、總黃酮含量都存在較大的相關(guān)性，其中與總酚含量的相關(guān)性要高于與總黃酮的。孫瑩瑩在研究中也發(fā)現(xiàn)葡萄醋的抗氧化活性與其總酚和總黃酮含量有極顯著的相關(guān)性[16]。

4 結(jié)論

從市場(chǎng)上選取了19個(gè)品種的食醋，其中12個(gè)濃色醋，7個(gè)白醋，對(duì)其抗氧化性(還原力和DPPH自由基清除率)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和比較，檢測(cè)了其總黃酮和總酚含量，分析兩者與抗氧化性的相關(guān)性來探討抗氧化性的形成機(jī)理。研究結(jié)果如下：

(1)抗氧化性較強(qiáng)的前5個(gè)食醋依次為10#(F牌香醋)、6#(B牌十年陳醋)、5#(B牌五年陳醋)、4#(B牌三年陳醋)、7#(C牌陳醋)，不同食醋的抗氧化性差異較大，白醋抗氧化性普遍低于濃色醋。

(2)總黃酮和總酚含量最高的分別為6#(B牌10年陳醋)和10#(F牌香醋)；白醋的總黃酮和總酚含量普遍低于濃色醋。

(3)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：DPPH自由基清除率與總酚含量的相關(guān)方程為y=35.014x-1.0304，相關(guān)系數(shù)R=0.98918，與總黃酮含量的相關(guān)方程為y=65.217x-1.8523，相關(guān)系數(shù)R=0.95450；還原力與總酚含量的相關(guān)方程為y=0.27665x-0.02581，相關(guān)系數(shù)R=0.98259，與總黃酮含量的相關(guān)方程為y=0.52009x-0.03679，相關(guān)系數(shù)R=0.95700，說明食醋的抗氧化性與其總酚、總黃酮含量都存在較大的相關(guān)性，其中與總酚含量的相關(guān)性更高。研究結(jié)果表明總酚和總黃酮是影響食醋抗氧化性的重要因素。