不同心血管危險(xiǎn)分層高血壓患者腸道菌群多樣性分析

陳維玉 陳揚(yáng)平， 馮婷 胡興衛(wèi) 周風(fēng)云路祥麒 張秋霞 張新祿 陳鵬 修建成

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2科研處（廣州510515）；3南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病生教研室（廣州510515）

高血壓是最常見的慢性非傳染性疾病，也是心腦血管疾病最主要的危險(xiǎn)因素之一［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)高血壓患者超過10 億。而且，隨著人口老齡化的發(fā)展，預(yù)計(jì)到2025年全球高血壓患病人數(shù)將上升至15 億［2］。高血壓是多因素共同作用、相互疊加的結(jié)果，尤其是遺傳因素和環(huán)境因素［3-4］，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年來，腸道微生物改變宿主健康狀況的潛在作用引起了國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明腸道微生態(tài)失調(diào)與高血壓密切相關(guān)［5］，16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)高血壓動(dòng)物和高血壓人群均存在腸道微生態(tài)的失調(diào)［6］。LI 等［7］對(duì)高血壓前期及高血壓患者進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，并將高血壓患者糞便移植到無菌小鼠體內(nèi)，其結(jié)果證實(shí)了異常腸道微生物在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用，并強(qiáng)調(diào)了早期干預(yù)對(duì)高血壓前期的意義。有趣的是，高血壓的分級(jí)與患者富集的基因關(guān)聯(lián)群組（metagenomic linkage groups，MLG）的豐度呈正相關(guān)，而與健康組富集的MLG 豐度呈負(fù)相關(guān)，表明微生物相對(duì)豐度可能是高血壓發(fā)展的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素［8］。

高血壓是一種多病因相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜性進(jìn)行性心血管綜合征，血壓數(shù)值只是高血壓的一項(xiàng)生物指標(biāo)，并不能決定其預(yù)后。臨床實(shí)踐中將高血壓人群的心血管風(fēng)險(xiǎn)分為低危、中危、高危和很高危。研究證實(shí)，心血管危險(xiǎn)分層對(duì)各種心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）事件發(fā)生（心肌梗死、心血管死亡率、總死亡率及主要心血管事件）具有非常好的預(yù)測(cè)價(jià)值［9］。因此，本研究擬探索不同心血管危險(xiǎn)分層高血壓患者腸道菌群組成及豐度的變化，以進(jìn)一步揭示高血壓疾病進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制，為降低高血壓心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象本研究共入組85 例原發(fā)性高血壓患者，根據(jù)2018 歐洲高血壓指南［10］將患者分為高血壓低中危組（LI 組）、高危組（H 組）及很高危組（VH組），所有個(gè)體均來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心血管內(nèi)科。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者＜18 歲；（2）患有腫瘤、心力衰竭、心肌梗死、呼吸道感染等疾病；（3）2 個(gè)月內(nèi)接受過抗生素或益生菌治療。該研究通過了南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)關(guān)于開展臨床研究的審批，充分告知入組病人并獲簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 患者資料收集患者的資料分為基本資料和臨床資料?；举Y料包括：姓名、性別、年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、吸煙、心功能、既往病史（高血壓、冠心病、糖尿病、慢性肺病、心外動(dòng)脈疾病等）。臨床檢查資料包括：患者血壓、生化及檢查指標(biāo)。患者的血壓以患者入院時(shí)測(cè)量的肱動(dòng)脈壓為準(zhǔn)，測(cè)量方法符合《中國血壓測(cè)量指南》的標(biāo)準(zhǔn)。生化指標(biāo)通過患者入院抽血檢查中獲得，包括血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血清肌酐等；檢查指標(biāo)包括：心臟射血分?jǐn)?shù)、肺動(dòng)脈壓等。

1.2.2 患者心血管危險(xiǎn)因素分層根據(jù)2018年歐洲高血壓指南［10］，將患者分為高血壓低中危組、高危組、很高危組3 組。其中，Score 評(píng)分是評(píng)估高血壓患者10年心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)，使用在線網(wǎng)站（http：//www.euroscore.org/calc.html）計(jì)算各患者Score 評(píng)分，按照2018 歐洲高血壓指南將Score 評(píng)分≥10%，或重度慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）、伴有靶器官損害的糖尿病、達(dá)到50%以上的血管狹窄、或發(fā)生臨床心血管疾病（包括ACS、卒中等）評(píng)為很高危；Score 評(píng)分5% ～10%，或單個(gè)危險(xiǎn)因素（尤其是膽固醇）顯著升高、3 級(jí)高血壓、無靶器官損害的糖尿病患者、高血壓伴左室肥厚、中度CKD 為高危；Score 評(píng)分1% ～5%，或2 級(jí)高血壓為中危；10年Score 評(píng)分＜1%為低危。

1.2.3 樣品采集和DNA 提取收集患者的新鮮糞便樣本，20 min 內(nèi)置于液氮罐中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存。稱取糞便樣品20～50 mg，加PBS和0.5% Tween-20 混 勻 進(jìn) 行-80 ℃10 min 和60 ℃5 min 反復(fù)凍融3 次，用蛋白酶K、RNA 裂解酶和10% SDS 于55 ℃金屬浴中裂解糞便樣品，離心取上清，加入酚、氯仿、NaoAC 和異丙醇抽提菌液DNA，并用75% 乙醇洗滌沉淀，最后將DNA 樣品溶解于雙蒸水中。采用Qubit 對(duì)DNA 濃度進(jìn)行定量，并通過Agilent 2100 評(píng)價(jià)DNA 完整性，將DNA質(zhì)量合格的樣本用于文庫構(gòu)建。

1.2.4 文庫構(gòu)建采用二步PCR 方法構(gòu)建樣本文庫，以不同樣本DNA為模板，通過PCR反應(yīng)完成第一輪擴(kuò)增，采用磁珠法純化PCR 產(chǎn)物，然后用含有不同index 的引物進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增，再經(jīng)磁珠純化后，應(yīng)用Qubit 和Agilent 2100 檢測(cè)文庫質(zhì)量。最后采用Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 16S rDNA 高通量測(cè)序采用Illumina HiSeq 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。文庫制備完成后，簇生成和測(cè)序都在HiSeq 上完成。對(duì)提取的DNA 樣本進(jìn)行16S rDNA V3V4 區(qū)基因擴(kuò)增及測(cè)序，擴(kuò)增引物為5′-GTGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′。對(duì)各樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和總體測(cè)序分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量序列和低復(fù)雜度序列，利用重疊關(guān)系進(jìn)行序列拼接。應(yīng)用Usearch 10.0軟件在97%相似度下聚類得到操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）并去除嵌合體序列。基于Greengene 數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU 代表序列進(jìn)行比對(duì)和物種注釋?；诿總€(gè)注釋物種得到的reads 豐度，利用Kruskal-Wallis 方法計(jì)算3 組患者物種注釋上的豐度差異情況。使用Qiime 1.9.0 軟件基于OTU 的分析結(jié)果，抽取一組N 條reads（N 小于reads 總數(shù)M），進(jìn)行樣品微生物α多樣性分析，通過α 多樣性分析能夠了解樣品中微生物多樣性程度，多樣性指數(shù)包含Observes species、Shannon 指數(shù)等，并根據(jù)分析結(jié)果做出稀釋曲線。使用Qiime 1.9.0 軟件，匯總不同樣本中屬于相同物種的reads數(shù)據(jù)，計(jì)算樣本間距離矩陣，得到的矩陣用于PCoA 可視化進(jìn)行樣品微生物β多樣性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用R 3.5.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布且使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，其他使用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，計(jì)數(shù)資料用率來表示。使用One way ANOVA 進(jìn)行兩組以上正態(tài)分布資料的檢驗(yàn)，其他使用kruskal-wallis H 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)計(jì)量資料；計(jì)數(shù)資料比較用R×C 格表χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)或確切概率檢驗(yàn)。spearman 相關(guān)分析用來評(píng)價(jià)腸道菌群與Score 評(píng)分相關(guān)性。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高血壓不同危險(xiǎn)分層患者腸道微生物的組成和多樣性分析本項(xiàng)目共入組85 例原發(fā)性高血壓患者，根據(jù)2018 歐洲高血壓指南進(jìn)一步分為高血壓低中危組、高危組和很高危組。3 組患者的人口學(xué)及臨床資料特征見表1。結(jié)果顯示，除血壓、年齡、血清肌酐和臨床并發(fā)癥外其余指標(biāo)的組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

為研究不同心血管危險(xiǎn)分層高血壓患者的腸道菌群組成，本項(xiàng)目對(duì)糞便樣品進(jìn)行了16S rDNA高通量測(cè)序，獲得了3 860 470 條高質(zhì)量序列（平均每個(gè)樣品45 417 條）。α多樣性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著高血壓危險(xiǎn)分層的升高，患者腸道微生物的Shannon和Observed_species指數(shù)均顯示出降低的趨勢(shì)（圖1A、B），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。加權(quán)的主坐標(biāo)分析（weighted principal coordinate analysis，WPCoA）結(jié)果表明：3 組患者之間的腸道菌群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1C）。

表1 研究人群的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of the study cohort M（Q1，Q3）

2.2 高血壓不同危險(xiǎn)分層患者腸道菌群顯著性差異分析基于Qiime 1.9.0軟件分析得出的腸道菌群相對(duì)豐度，進(jìn)一步應(yīng)用R3.5.2 軟件分析組間物種屬水平的差異。結(jié)果顯示高血壓低中危組、高危組和很高危組的腸道菌群的組成存在顯著差異，羅斯氏菌屬（VH vs. LI，P＜0.001；H vs. LI，P＜0.01）和Anaerostipes 菌屬（VH vs. LI，P＜0.01；H vs. LI，P＜0.01）在很高危組和高危組中的豐度相對(duì)低中危組顯著降低，而很高危組放線菌屬（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.01）、瘤胃球菌屬（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.05）、毛螺旋菌屬（VH vs.H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.01）、嗜膽菌屬（VH vs.H，P＜0.001；VH vs. LI，P＜0.05）和SMB53 菌屬（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.05）的相對(duì)豐度顯著低于高危組和低中危組（圖2）。

圖1 3 組患者之間腸道微生物多樣性分析Fig.1 Analysis of gut microbiota diversity between three groups of patients

圖2 3 組患者之間存在顯著差異的菌屬Fig.2 Significant differences between the three groups of bacteria

2.3 腸道菌群與Score 評(píng)分相關(guān)性分析為了探究腸道菌群與高血壓患者發(fā)生心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，本研究統(tǒng)計(jì)了入組患者的年齡、性別、血清肌酐、心臟射血分?jǐn)?shù)、肺動(dòng)脈壓、既往病史（如心臟疾病、糖尿病、慢性肺病、心臟外動(dòng)脈疾病等）等臨床指標(biāo)，根據(jù)EuroScoreⅡ3 系統(tǒng)進(jìn)一步計(jì)算出患者的Score 評(píng)分，并就其與腸道微生物作Spearman 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，克雷伯氏菌屬（r = 0.238，P＜0.05）和顫螺旋菌屬（r=0.243，P＜0.05）的豐度與Score 評(píng)分呈正相關(guān)，而毛螺旋菌屬（r=-0.491，P＜0.001）和羅斯氏菌屬（r =-0.385，P＜0.01）的豐度與Score 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（圖3）。

3 討論

既往多項(xiàng)研究［6，11］表明，高血壓患者存在明顯的腸道菌群紊亂及腸黏膜屏障功能失調(diào)，而且，腸道菌群在阻塞性呼吸睡眠暫停大鼠誘導(dǎo)高血壓過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］，以上顯示腸道菌群在高血壓發(fā)生過程中的重要地位，提示腸道菌群檢測(cè)具有疾病診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的潛在價(jià)值，同時(shí)有可能成為高血壓新的干預(yù)靶點(diǎn)。本研究通過分析不同心血管危險(xiǎn)分層高血壓患者腸道菌群的差異，探索高血壓危險(xiǎn)分層相關(guān)的疾病特征菌，為基于機(jī)器學(xué)習(xí)的心血管事件風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示不同危險(xiǎn)分層的高血壓患者，其腸道菌群的α多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，菌群相對(duì)豐度存在顯著差異。

圖3 Score 評(píng)分與菌屬之間Spearman 相關(guān)性分析Fig.3 Spearman correlation analysis between the Score value and bacteria

在屬的水平，很高危組及高危組患者的羅斯氏菌和Anaerostipes 菌的相對(duì)豐度較低中危組的患者顯著降低，而放線菌、瘤胃球菌、毛螺旋菌、嗜膽菌和SMB53 在很高危組患者中的相對(duì)豐度顯著低于高危組及低中危組患者（P＜0.05）。據(jù)報(bào)道，羅斯氏菌和Anaerostipes 為丁酸產(chǎn)生菌［13］，丁酸鹽可以通過上調(diào)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)來維持腸粘膜完整性，進(jìn)而阻止脂多糖、三甲胺等有害產(chǎn)物進(jìn)入血液［14］。毛螺旋菌為丙酸產(chǎn)生菌［13］，瘤胃球菌的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸［15］，而乙酸、丙酸和丁酸均屬于短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），是腸道微生物發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的代謝物。既往研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs 可以通過嗅覺感受器受體（olfactory receptor78，Olfr78）和G 蛋白偶聯(lián)受體41（G protein-coupled receptor 41，Gpr41）調(diào)控血壓，從而維持血壓的穩(wěn)態(tài)［16］。MARQUES 等［17］也證實(shí)了高纖維飲食和補(bǔ)充乙酸酯均可以明顯降低鹽皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠血壓水平、減少心肌纖維化和左心室肥厚，其機(jī)制是通過調(diào)節(jié)心臟和腎臟Egr1、腎臟RAAS 和心臟MAPK 的表達(dá)來發(fā)揮作用的。本研究也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生SCFAs 的羅斯氏菌、Anaerostipes、毛螺旋菌和瘤胃球菌的豐度隨著高血壓心血管危險(xiǎn)程度的增加而顯著降低，提示SCFAs 有可能成為評(píng)估心血管事件的新的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

此外，本研究通過Spearman 相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)羅斯氏菌屬和毛螺旋菌屬豐度與Score 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，而克雷伯氏菌屬和顫螺旋菌屬豐度與Score 評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）。既短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌羅斯氏菌和毛螺旋菌的豐度與高血壓10年心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。因此，本研究推測(cè)這兩種菌可能是降低心血管危險(xiǎn)的有益菌。最近發(fā)表在Nature Microbiology 的一項(xiàng)研究表明，通過給ApoE-/-無菌小鼠定殖不同產(chǎn)丁酸能力的特定菌群，發(fā)現(xiàn)在富含植物多糖的飲食作用下，腸道羅斯氏菌可調(diào)節(jié)結(jié)腸表觀遺傳，使腸細(xì)胞從糖酵解向利用脂肪酸轉(zhuǎn)變，降低內(nèi)毒素和炎癥反應(yīng)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［18］。這與本研究結(jié)果是互為補(bǔ)充的?？死撞暇皖澛菪c高血壓10年心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。已有研究［7］報(bào)道，在高血壓前期和高血壓人群中普氏菌和克雷伯氏菌以及與疾病相關(guān)的微生物過度生長。并且，克雷伯氏菌可以通過脂多糖激發(fā)的免疫應(yīng)激導(dǎo)致炎癥反應(yīng)［19］。這提示，通過微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)調(diào)整腸道微生態(tài)的平衡可能有助于腸道正常菌群的恢復(fù)，從而預(yù)防心血管事件的發(fā)生，但仍需更有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

本研究存在一定的局限性。首先，入選人群均來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院門診和住院病人，具有明顯的地域局限性。其次，由于對(duì)本研究的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格控制，導(dǎo)致入組的人數(shù)有限，這對(duì)研究結(jié)果的普遍性也具有一定的影響，還需更大樣本研究加以證實(shí)。另外，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物（如SCFAs）和高血壓心血管危險(xiǎn)分層之間的因果關(guān)系也需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究對(duì)不同心血管危險(xiǎn)分層高血壓患者腸道菌群的組成及多樣性做了初步探索，證實(shí)高血壓發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)與腸道菌群之間存在一定的關(guān)系。通過構(gòu)建相關(guān)模型，腸道菌群有望成為一項(xiàng)新的預(yù)測(cè)和監(jiān)控高血壓發(fā)生心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的臨床指標(biāo)。