LINC00152 在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義

雷珊 曾智銳 薛燕 蘭金芝 孫遠(yuǎn)梅 陳騰祥，

貴州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽(yáng)550004）

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，因早期極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移且缺乏特異性的診斷指標(biāo)，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期［1］，手術(shù)是目前治療胰腺癌有效的手段之一，但復(fù)發(fā)率極高。至今，胰腺癌的病因及發(fā)展機(jī)制尚不清楚，仍缺少有效的靶向治療靶點(diǎn)及分子標(biāo)志物［2］。有研究表明，胰腺癌的發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素參與的過(guò)程，因此從分子水平闡明胰腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找特定有效的靶向治療分子靶點(diǎn)可能是早期診斷和治療胰腺癌的重要手段之一［3-4］。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)堿基序列且自身沒(méi)有編碼蛋白能力的RNA，主要是通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及染色體重構(gòu)等多種途徑參與基因表達(dá)，具有調(diào)節(jié)各種生物過(guò)程的潛力［5］。研究表明，LncRNA 的表達(dá)與多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，例如LncRNA ROR 在胰腺癌組織中高表達(dá)且促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖［6］，LncRNA PVT1 促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移［7］等。然而在最新研究報(bào)道中，LINC00152 在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［8-9］。且在本課題前期篩選基因時(shí)發(fā)現(xiàn)LINC00152 在胰腺癌組織中異常高表達(dá)?；诖?，本研究進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR 法檢測(cè)6 株人胰腺癌細(xì)胞系和人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、胰腺癌組織和癌旁組織中LINC00152 的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其與患者臨床病理特征及其預(yù)后的關(guān)系，為胰腺癌的治療和預(yù)后分析提供新的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及組織人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，MIA PaCa-2，Panc 03.27，AsPC-1，SW1990，CFPAC-1 和人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE 均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，細(xì)胞均采用在10% 胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基、5%CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)，每2 天更換一次新鮮培養(yǎng)基，融合度達(dá)85%左右進(jìn)行傳代。狀態(tài)好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。組織標(biāo)本從華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院和貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床樣本庫(kù)中獲得胰腺癌組織及其癌旁組織共100 例，所有患者在手術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及生物免疫治療等任何抗腫瘤治療，并且未合并其他器官的惡性腫瘤。全部標(biāo)本均由組織學(xué)確診。100 例組織中，男63 例，女37 例；年齡＜60 歲有47 例，≥60 歲有53 例；腫瘤直徑＜3 cm 有53 例，腫瘤直徑≥3 cm 有47 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期有68例，Ⅲ+Ⅳ期有32例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有49例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有51 例，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的使用均獲得了患者本人及其家屬的同意，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均由倫理委員會(huì)證實(shí)符合倫理學(xué)規(guī)范。

1.2 試劑及儀器高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自Gibco 生物公司（美國(guó)），TRIzol 試劑購(gòu)自Invitrogen 生物公司（美國(guó)）；PCR 相關(guān)試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 生物公司（日本）；LINC00152 和內(nèi)參GAPDH 引物設(shè)計(jì)及合成皆由武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司完成。熒光PCR 檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自BIO-RAD（美國(guó)）。

1.3 檢測(cè)組織和細(xì)胞中LINC00152 的表達(dá)用TRIzol 法提取組織及細(xì)胞中的總RNA，總RNA 經(jīng)過(guò)70%乙醇洗滌后用無(wú)酶水稀釋，取1 μL 稀釋后的RNA 滴加在用分光光度計(jì)中，檢測(cè)提取的總RNA 的濃度及純度，測(cè)得的RNA 的吸光度（A）值，其中RNA的A260 nm/A280 nm 在1.8～2.0范圍內(nèi)的為合格樣品，用于逆轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)。取1 000 ng的總RNA，按照TaKaRa 試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA 為模板，qRT-PCR 試劑盒和引物為試劑，按照公司提供的PCR 的反應(yīng)步驟，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。結(jié)果以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00152 的相對(duì)表達(dá)量。LINC00152 上游引物序列：aaaatcacgactcagccccc，LINC00152 下游引物序列：aatgggaaaccgaccagacc；GAPDH 上游引物序列：ggagcgagatccctccaaaat，GAPDH 下游引物序列：ggctgttgtcatacttctcatgg。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以± s 表示，組間比較用t 檢驗(yàn)表示，不同處理組間采用單因素方差分析，LINC00152 的表達(dá)與患者的臨床性狀關(guān)系采用卡方分析；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲線描繪及分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00152 在人胰腺癌細(xì)胞系和人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系中的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示：以HPDE 細(xì)胞中的LINC00152 表達(dá)水平（1.01±0.02）作為對(duì)比，PANC-1、MIA PaCa-2、Panc 03.27、AsPC-1、SW1990、CFPAC-1 的LINC00152 相對(duì)表達(dá)水平分別為：（3.01 ± 0.12）、（2.84 ± 0.03）、（2.56 ±0.16）、（2.36 ± 0.21）、（2.24 ± 0.06）、（2.16 ± 0.14）。6 種人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，MIAPaCa-2、Panc 03.27、AsPC-1、SW1990、CFPAC-1 中LINC00152 的表達(dá)水平顯著高于人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE，差異結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 LINC00152 在人胰腺癌細(xì)胞系和人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of LINC00152 in human pancreatic cancer cells and human pancreatic ductal cell

2.2 LINC00152 在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)LINC00152 在胰腺癌組織和臨近的癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，LINC00152 在人胰腺癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中相對(duì)表達(dá)水平分別為（1.02±0.14）、（8.48±0.46）。與癌旁組織相比，胰腺癌組織中LINC00152的表達(dá)水平顯著升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 人胰腺癌組織和癌旁組織中的LINC00152 表達(dá)水平Fig.2 Expression of LINC00152 in human pancreatic cancer tissuse and adjacent pancreatic tissuse

2.3 LINC00152 表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系以LINC00152 的表達(dá)水平均值為界值，將患者分為L(zhǎng)INC00152 高表達(dá)（≥7.55）組（n=50）和LINC00152低表達(dá)（＜7.55）組（n=50），用卡方檢驗(yàn)分析LINC00152 的表達(dá)與胰腺癌患者在臨床上的病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，LINC00152的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)（均P＜0.05），而與患者的腫瘤直徑的大小、性別及年齡無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.4 胰腺癌組織中LINC00152 表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系將100 例胰腺癌患者分為L(zhǎng)INC00152 高表達(dá)組和LINC00152 低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示，相對(duì)于LINC00152低表達(dá)組，高表達(dá)組患者的生存率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明癌組織中LINC00152表達(dá)水平可影響患者預(yù)后。見(jiàn)圖3。

3 討論

作為消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，胰腺癌已躍居惡性腫瘤死亡的第4 位，全世界胰腺癌的發(fā)病率與死亡率逐年增長(zhǎng)，到2030年胰腺癌預(yù)計(jì)成為第二大癌癥死亡原因［10-11］，80% 的癌癥患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有局部轉(zhuǎn)移［12］。手術(shù)是主要治療方式，雖然胰腺癌的手術(shù)及化療取得了一定進(jìn)展，然而目前胰腺癌治愈性切除率僅5% ，且術(shù)后并發(fā)癥多，導(dǎo)致手術(shù)療效不盡如人意［13］。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是其治愈率低的主要原因，這個(gè)問(wèn)題無(wú)法通過(guò)手術(shù)解決，而早期診斷和靶向治療可以成為綜合治療的手段彌補(bǔ)手術(shù)治療的不足。分子靶點(diǎn)包括了DNA和蛋白質(zhì)，而今年來(lái)非編碼的RNA 也發(fā)現(xiàn)參與了基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控，和腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

表1 胰腺癌組織中LINC00152 的表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The expression of LINC00152 in pantients with pancreatic cancer and corresponding clinical data 例

圖3 胰腺癌組織中的不同LINC00152 的表達(dá)水平患者的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.3 Kaplan-Meier survival curve was performed to detect the effect of LINC00152 on pancreatic cancer patient outcome

在非編碼的RNA中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）也參與的基因的表達(dá)調(diào)控，是表觀遺傳學(xué)中的重要內(nèi)容。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在多種癌癥中表達(dá)異常，通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及遷移生物學(xué)和病理生理學(xué)過(guò)程，是目前的研究熱點(diǎn)之一［14］。有研究表明，LINC00152 在多種惡性腫瘤組織的表達(dá)水平出現(xiàn)異常，如SUN等［15］報(bào)道LINC00152 作為miR-497 的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 下調(diào)其下游靶腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF，從而促進(jìn)如乳頭狀甲狀腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；CHEN等［16］發(fā)現(xiàn)，LINC00152 在卵巢癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)，LINC00152 的基因沉默可以抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。目前，有關(guān)LINC00152 在胰腺癌中表達(dá)情況的研究甚少。

本研究檢測(cè)了人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，MIA PaCa-2，Panc 03.27，AsPC-1，SW1990，CFPAC-1 和人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE 中LINC00152 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE，LINC00152 在其它6 株胰腺癌細(xì)胞系均有不同程度的表達(dá)上調(diào)。本研究還檢測(cè)了100例胰腺癌臨床病例的癌組織及癌旁組織中LINC00152 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁組織，LINC00152在癌組織中表達(dá)顯著增高；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，LINC00152 的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及TNM 分期密切相關(guān)，與患者的腫瘤直徑的大小、性別及年齡等因素沒(méi)有相關(guān)性，提示LINC00152表達(dá)的上調(diào)與胰腺癌轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性。

然而，LINC00152 在胰腺癌中的表達(dá)上調(diào)是否影響胰腺癌的預(yù)后，目前還沒(méi)有報(bào)道。本研究選取了100 例胰腺癌患者，根據(jù)表達(dá)水平，將患者分為L(zhǎng)INC00152 高表達(dá)組和LINC00152 低表達(dá)組，通過(guò)病人后期的隨訪信息，繪制了生存曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00152 高表達(dá)組的患者存活時(shí)間較短，預(yù)后較差，而LINC00152 低表達(dá)組患者存活時(shí)間較長(zhǎng)，預(yù)后相對(duì)較好。這個(gè)結(jié)果與其他課題組在胃癌、宮頸癌和肝癌中的發(fā)現(xiàn)相一致［17-19］，提示LINC00152 可以作為判斷胰腺癌預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，胰腺癌中LINC00152 表達(dá)異常增高，是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，本研究為胰腺癌的靶向治療以及預(yù)后分析提供了新的方向。