右美托咪定對早期膿毒癥大鼠肺水通道蛋白基因表達及炎癥因子的影響

雷賢英 伍長學(xué)

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院ICU（四川瀘州646000）

膿毒癥是由細菌或內(nèi)毒素感染機體激活非特異性免疫反應(yīng)引起的一種嚴重疾病。右美托咪定（dexmedetomidine）作為具有代表性的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物之一，有研究表明其具有顯著的抗炎作用和肺保護作用［1］，但其具體肺保護機制仍不明確。本研究通過觀察右美托咪定對早期膿毒癥大鼠水通道蛋白（aquaporin，AQP）基因表達的影響，以探討右美托咪定在膿毒癥救治中的器官保護作用和機制，以尋找出治療膿毒癥的新方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康25月齡雄性Wistar大鼠40 只（西南醫(yī)科大學(xué)SPF 實驗動物中心提供，許可證：SYXK（川）2013-065），體質(zhì)量200～250 g。均飼養(yǎng)在SPF 級環(huán)境中，飼喂全價顆粒料，自由進食和飲水。實驗前禁食6 h，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制和藥物處理于2015年3-6月，采用隨機數(shù)字表法，將40 只大鼠分為5 組（n = 8），分別為對照組（生理鹽水組）、膿毒癥模型組、右美托咪定低劑量治療組、右美托咪定中劑量治療組、右美托咪定高劑量治療組。采用清醒經(jīng)大鼠尾靜脈穿刺置留置針（22 號留置針）方法行尾靜脈保留置管，肝素水封管后絲線固定以備給藥。對照組以1 mL/kg 注射0.9% 生理鹽水，膿毒癥模型組以5 mg/kg 給予脂多糖復(fù)制膿毒癥大鼠模型（10 min 以上注射完），右美托咪定高/中/低治療組在5 mg/kg 注射LPS 建模成功后立即靜脈泵注負荷劑量右美托咪定（6.5 μg/kg，10 min 泵完），再分別按照4.5、1.5、0.5 μg/（kg·h）持續(xù)泵入右美托咪定6 h。

1.2.2 標本采集6 h 后用1%戊巴比妥鈉靜脈緩慢注射麻醉處死大鼠，無菌條件下取下肺組織，將部分肺組織于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標

1.3.1 熒光定量PCR 檢測AQP1 基因的表達取-80 ℃冷凍保存的大鼠肺組織，于研缽中剪碎后加入足量的液氮進行快速研磨，轉(zhuǎn)移組織粉末至無RNA 酶的EP 管中，加入1 mL Trizol，吹打混勻，室溫放置5 min；加入0.2 mL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min，待自然分層；4 ℃，12 000 r/min 離心15 min，小心吸取上層水相于一新的1.5 mL EP 管中；加入0.5 mL 異丙醇，上下顛倒混勻，于室溫靜置10 min，于4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，于管底部可見膠狀沉淀；棄上清，加入75%乙醇1 mL（用0.1% DEPC 配制），上下顛倒混懸洗滌RNA 沉淀；于4 ℃下7 500 r/min 離心6 min，棄去上清，再加入75%乙醇1 mL，重復(fù)1 次；超凈工作臺內(nèi)自然干燥5～10 min，待RNA 呈半透明狀態(tài)時，加30 μL 0.1% DEPC 水進行充分溶解。取0.5 μg 總RNA 做模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制20 μL 反應(yīng)體系，42 ℃20 min，99 ℃5 min 進行cDNA 合成反應(yīng)。取SYBR 2×Premix Ex TaqTMII，上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，cDNA 2 μL，在ABI7500熒光定量PCR 儀中以下參數(shù)進行擴增：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 個循環(huán)，讀板獲得融解曲線。得到每個樣品的Ct 值，以空白對照組為對照，以18sRNA 為內(nèi)參基因（表1），計算每個樣品的目的基因的相對表達量2-△△Ct，△△Ct =（待測組目的基因平均Ct值-待測組內(nèi)參基因平均Ct 值）-（對照組目的基因平均Ct 值-對照組內(nèi)參基因平均Ct 值），比率待測組/對照組=2-△△Ct。

表1 目的基因引物信息Tab.1 Information of target gene primer

1.3.2 肺組織干濕重（W/D）比值測定取部分肺組織，拭干表面血液后稱其質(zhì)量，即為濕質(zhì)量；采用真空干燥法，將稱重后的肺組織置真空干燥箱內(nèi)，70 ℃，真空4 mmHg 條件下烘烤22 h 后稱干重，計算W/D。

1.3.3 雙抗體ELISA 法檢測相關(guān)細胞因子取大鼠部分肺葉，制備10%的肺組織勻漿，于4 ℃下3 000 r/min離心15 min，迅速取其上清液，按照雙抗體夾心ELISA 法試劑盒說明書操作，測定TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法所有結(jié)果均以均數(shù)±標準差表示，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。不同組間比較采用單因素方差分析。若組間存在顯著性差異，進一步用Student-Newman-Keuls 法進行兩兩比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP1、AQP5 基因表達比較與對照組比較，膿毒癥組AQP1、AQP5 基因表達量顯著降低；用中、低劑量右美托咪定干預(yù)處理后，AQP1、AQP5基因表達量出現(xiàn)一定程度的升高，但變化不明顯（P ＞0.05，表2），在高劑量藥物處理組，AQP1、AQP5 基因的表達與膿毒癥組比較，出現(xiàn)明顯增加（P ＜0.05，表2）。

表2 肺組織中AQP1、AQP5 表達變化Tab.2 Expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue ±s，μg/L

表2 肺組織中AQP1、AQP5 表達變化Tab.2 Expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue ±s，μg/L

注：與對照組比較，*P ＜0.001，△P ＜0.001；與膿毒癥組比較，#P ＜0.001，■P ＜0.001

分組對照組膿毒癥組低劑量組中劑量組高劑量組樣本量8 8 8 8 8 AQP1 1.072 6±0.491 6 0.119 7±0.034 4*0.253 7±0.012 0 0.295 3±0.004 7 0.966 1±0.171 2#AQP5 1.055 7±0.006 9 0.126 5±0.087 1△0.200 8±0.006 9 0.387 1±0.057 0 1.157 5±0.397 9■

2.2 各組肺W/D 比值比較與膿毒癥組比較，中、低劑量治療組W/D 值無明顯差異（P ＞0.05，表3），高治療劑量組W/D 值顯著降低（P ＜0.05，表3）。

表3 各組肺W/D 比值和肺組織病理學(xué)評分比較Tab.3 Comparison of lung W/D ratio and pathological score in lung tissue of each group ±s

表3 各組肺W/D 比值和肺組織病理學(xué)評分比較Tab.3 Comparison of lung W/D ratio and pathological score in lung tissue of each group ±s

注：與對照組比較，△P = 0.003，*P = 0.043；與膿毒癥組比較，#P=0.01

分組對照組膿毒癥組低劑量組中劑量組高劑量組樣本量8 8 8 8 8肺W/D 值4.66±0.51 5.72±0.52△5.28±0.49 5.30±0.43 4.82±0.54#肺組織病理學(xué)評分（分）3.26±1.10 6.61±1.75*5.30±1.87 5.26±1.96 5.04±2.01

2.3 肺組織病理學(xué)評分膿毒癥組肺組織病理學(xué)評分明顯高于對照組（P ＜0.05）；各治療組的評分雖低于膿毒癥組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）。見表3。

2.4 肺組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 濃度比較膿毒癥組肺組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 濃度在用脂多糖造模后表達升高；將高/中/低劑量各治療組與膿毒癥組進行比較，各治療組TNF-α 的濃度均出現(xiàn)明顯降低（P ＜0.05），各治療組肺組織中IL-1β 的濃度變化不大（P ＞0.05），IL-6 的濃度在高劑量治療組降低明顯（P ＜0.05，表4）。

3 討論

右美托咪定是ICU、麻醉科常用的鎮(zhèn)靜劑之一，臨床應(yīng)用已比較廣泛，能夠有效緩解患者焦慮、譫妄、疼痛等癥狀，可以改善舒適度，具有較強的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，保證危重患者有創(chuàng)治療和操作的安全實施［2］，還常用于圍術(shù)期鎮(zhèn)靜及預(yù)防氣管插管反應(yīng)［3］。右美托咪定是一種新型高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑（α2AR），其內(nèi)在活性優(yōu)于可樂定，對患者意識程度影響較小，主要作用于腦干藍斑區(qū)的α2 受體，抑制交感神經(jīng)的活性，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等功效，同時還具有止涎、抗寒顫等作用，且能夠維持患者正常的免疫反應(yīng)。有實驗證實，α2 受體激動劑能抑制外周單核巨噬細胞等的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生。α2 受體也廣泛分布于延髓、周圍血管及外周重要臟器等部位（包括肺、心臟、大腦等）。近年來，有學(xué)者對右美托咪定的臟器保護作用進行了研究，其結(jié)果顯示對大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺等均具有一定的保護作用，但其具體機制目前還不太明確［4-5］。有臨床觀察［6］顯示，右美托咪定能減少老年患者術(shù)后譫妄的發(fā)生率，能降低譫妄測驗（CAM-CR）評分。SHI 等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖引起的急性肺損傷動物模型中，證實右美托咪定能減少肺組織中TLR4 mRNA表達，抑制肺組織的炎性反應(yīng)，并且降低肺組織重量-體重比，減輕肺水腫，減少胸膜滲出，從而起到肺保護的作用。對呼吸機所致肺損傷的動物實驗中，觀察到大劑量右美托咪定組血漿中的炎性因子明顯減少，肺組織水腫顯著減輕［8］。在脂多糖聯(lián)合IFN-γ刺激引起肺巨噬細胞活性損傷中，右美托咪定明顯降低了NR8383 細胞中iNOS 的表達量，該效應(yīng)可能是通過α2 腎上腺素受體進行介導(dǎo)的［9］。CHIH 等［10］在觀察右美托咪定聯(lián)合氯胺酮應(yīng)用于內(nèi)毒素血癥大鼠機械通氣致肺損傷引發(fā)的肺部炎癥反應(yīng)中，觀察到二者聯(lián)用降低了BALF 小鼠總細胞數(shù)以及MIP-2、IL-β的濃度，同時降低了肺部W/D，能有效減輕肺部炎癥反應(yīng)。

表4 肺組織炎癥因子檢測結(jié)果Tab.4 Results of inflammatory factor in lung tissue ±s，ng/L

表4 肺組織炎癥因子檢測結(jié)果Tab.4 Results of inflammatory factor in lung tissue ±s，ng/L

注：與對照組比較，aP ＜0.001，*P=0.003；與膿毒癥組比較，bP=0.044，cP=0.035，dP=0.01，eP=0.02

分組對照組膿毒癥組低劑量組中劑量組高劑量組IL-6 4.036 0±1.645 5 7.986 6±2.447 1*6.082 3±2.108 8 5.363 7±0.200 0 4.162 6±0.090 5d樣本量8888 8 TNF-α 5.035 6±1.694 8 14.845 4±5.767 7a 9.392 7±0.768 7b 9.111 0±0.117 8c 8.396 0±2.565 1e IL-1β 5.531 4±1.739 2 7.656 8±3.289 6 5.209 7±0.218 7 2.836 0±0.144 9 4.981 3±0.727 3

急性肺損傷是膿毒癥時ARDS 的早期表現(xiàn)，臨床上以急性滲透性肺水腫和進行性缺氧性呼吸衰竭為主要表現(xiàn)。肺水腫是其發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)，隨著病情的發(fā)展，最終導(dǎo)致肺換氣功能障礙、肺內(nèi)分流增加，機體出現(xiàn)嚴重缺氧、內(nèi)環(huán)境紊亂以及多器官損害。機體肺泡內(nèi)肺水的轉(zhuǎn)運有兩種途徑：一是伴隨鈉離子的主動轉(zhuǎn)運，二是經(jīng)過肺泡上皮內(nèi)的AQP 進行轉(zhuǎn)運［11］。AQP 是一組與水通透性有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，通過水孔蛋白亞基的中心通道實現(xiàn)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運，在分子水平上經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)出入細胞膜的水量，在維持肺泡、肺間質(zhì)及肺毛細血管間的水平衡中起著重要的作用，尤其對清除肺泡內(nèi)多余液體起著主導(dǎo)作用［12］。整個肺組織以及呼吸道的微血管內(nèi)皮細胞中均有AQP1 表達，AQP5 則表達在Ⅰ型肺泡上皮細胞和黏膜下的腺細胞內(nèi)。這些AQPs 在機體出生時會顯著增加，并受生長因子、激素、炎癥因子和滲透應(yīng)力的調(diào)節(jié)［13］。通過增加肺組織中AQP1 和AQP5 的表達可能會減輕急性肺損傷以及肺出血的發(fā)生［14］。

本實驗結(jié)果顯示，用脂多糖造模后的膿毒癥組AQP1、AQP5 基因的表達量顯著降低（P ＜0.05），與對照組比較，膿毒癥組肺組織W/D 比值和病理學(xué)評分比較明顯升高，肺組織TNF-α、IL-1β和IL-6濃度在用脂多糖造模后表達升高。這種現(xiàn)象在高巨等［15］關(guān)于“失血性休克-內(nèi)毒素”二次打擊大鼠肺組織水通道蛋白表達的研究中也得到證實，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)、腺病毒感染、高氧刺激等引發(fā)的肺損傷動物模型中，均有AQP1 和AQP5 表達水平的下調(diào)，其表達水平與肺水腫和肺損傷的嚴重程度密切相關(guān)?？梢?，AQP1 和AQP5 在膿毒血癥相關(guān)的急性肺損傷中可能扮演更重要的角色。一系列的研究表明，炎癥因子在膿毒癥的發(fā)病機制中起著極其關(guān)鍵的作用，參與膿毒癥炎癥反應(yīng)的炎癥介質(zhì)主要為TNF-α、IL-1β和IL-6 等，由于炎性細胞因子大量釋放，誘導(dǎo)肺組織發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肺泡毛細血管通透性增加，肺泡內(nèi)液體的清除和轉(zhuǎn)運發(fā)生障礙，中性粒細胞被激活，活性氧、蛋白酶等生物活性物質(zhì)以及TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎細胞因子得以釋放，毛細血管內(nèi)皮細胞與肺泡上皮細胞間的緊密連接被破壞，肺泡毛細血管通透性增加。炎癥與水腫聯(lián)系密切，抑制促炎細胞因子的釋放，控制炎性反應(yīng)，能夠增加AQP1 和AQP5 的表達及其提高其活性，進而促進肺泡內(nèi)液體的清除。腫瘤壞死因子等炎癥介質(zhì)能夠通過調(diào)控基因來改變水通道蛋白的合成速率，調(diào)節(jié)膜細胞膜上水通道蛋白的含量，使水通道蛋白表達下調(diào)［16］。

基于右美托咪定的抗炎和肺保護效應(yīng)，本研究觀察到，高劑量藥物處理組AQP1、AQP5 基因的表達與膿毒癥組比較，出現(xiàn)明顯增加（P ＜0.05）；用中、低劑量右美托咪定干預(yù)處理后，AQP1、AQP5基因表達量出現(xiàn)一定程度的表達升高，但變化不明顯（P ＞0.05）；高治療劑量組W/D 值明顯降低（P ＜0.05）；各治療組TNF-α 的濃度均出現(xiàn)明顯降低（P ＜0.05），但IL-1β 的濃度變化不大（P ＞0.05），IL-6 的濃度在高劑量治療組降低明顯（P ＜0.05）。高劑量的右美托咪定能抑制外周單核巨噬細胞等的激活，減少TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生，這些炎性因子的減少可改善毛細血管內(nèi)皮細胞膜及肺泡上皮細胞膜上水通道蛋白基因（AQP1、AQP5）的表達，肺泡內(nèi)液體清除加速。通過抑制炎性反應(yīng)增加水通道蛋白基因（AQP1、AQP5）的表達，減輕肺泡毛細血管的通透性，改善肺泡內(nèi)液體的清除速率可能是右美托咪定肺保護的機制所在。

綜上所述，高治療劑量［4.5 μg/（kg·h）］的右美托咪定能促進早期膿毒癥大鼠AQP 基因的表達，降低肺組織W/D，減輕肺水腫，抑制炎癥因子的釋放，緩解肺損傷，具有肺保護的作用。