黃芪三萜皂苷對(duì)心肌重構(gòu)細(xì)胞模型的保護(hù)作用

壽鴻飛 劉晶 劉天龍 張銘杰 劉小雷

1烏蘭察布市中心醫(yī)院藥劑部（內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部（呼和浩特010030）；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室（呼和浩特010110）

心肌重構(gòu)是心臟在多種病理刺激下出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)和功能改變，以心室容積增加、心肌纖維化及心臟舒張和收縮功能障礙作為主要的臨床癥狀［1］。心肌重構(gòu)是最常見的高血壓靶器官損害，其作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素伴隨在進(jìn)行性心衰和梗死性心律失常的整個(gè)病理變化中［2］。目前，雖然多種基因、蛋白及非編碼RNA 被報(bào)道與心肌重構(gòu)的發(fā)生相關(guān)，但心肌重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上仍以控制血壓為主要的治療手段［3-5］。雖然降壓治療能夠顯著地降低高血壓患者發(fā)生心肌重構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)，但很多高血壓患者在較好控制血壓的條件下仍會(huì)出現(xiàn)心肌重構(gòu)表型，說明控制血壓對(duì)心肌重構(gòu)的防治效果并不理想［6］。因此，系統(tǒng)地研究心肌重構(gòu)的干預(yù)手段對(duì)于有效地預(yù)防和治療高血壓心衰具有重要的意義。

黃芪是蒙古黃芪干燥的根，具有止汗、滋補(bǔ)和利尿等功效，為內(nèi)蒙古自治區(qū)的道地藥材［7］。目前，臨床上有近百種與黃芪有關(guān)的中、蒙藥方劑和中成藥廣泛地用于心血管疾病的預(yù)防和治療，如芪冬頤心口服液、芪參膠囊及當(dāng)歸黃芪湯等［8-9］。黃芪三萜皂苷（Astragalus triterpenoid，AST）是黃芪的重要活性成分，其具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激及保護(hù)內(nèi)皮功能等作用，但關(guān)于AST 對(duì)心肌重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制目前還鮮有關(guān)注［10-11］。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及內(nèi)皮功能障礙與心肌重構(gòu)的發(fā)生有著密切的關(guān)系，因此，筆者推測(cè)AST 可能對(duì)心肌重構(gòu)具有保護(hù)作用［12］。本研究以AST 為研究對(duì)象，在體外系統(tǒng)地研究其對(duì)心肌重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制，這對(duì)于尋找心肌重構(gòu)新的干預(yù)靶點(diǎn)和治療手段具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物乳小鼠的原代心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞由本課題組分離和培養(yǎng)；重組人血管緊張素II（A9525）購(gòu)于Sigma 公司；AST（781-200311，純度＞98%）購(gòu)于中國(guó)生物制品鑒定所。

1.2 心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng)依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法分離和培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞水平研究AST 對(duì)AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心肌成纖維活化的保護(hù)作用［13］。簡(jiǎn)言之，使用0.062 5%的胰酶在37 ℃不斷攪拌下對(duì)心肌組織進(jìn)行逐次消化，每次消化5 min，每次消化完成后將含有細(xì)胞的消化液加入到10%FBS 的DMEM/高糖培養(yǎng)基中以終止胰酶活性。消化完成后，合并收集的細(xì)胞懸液，1 000 ×g 離心5 min。使用含10%FBS 的DMEM/高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞接種于10 cm 皿中，在37 ℃，2.5%CO2的條件下進(jìn)行差速貼壁2 h。差速貼壁完成后，貼壁的心肌成纖維細(xì)胞繼續(xù)使用含10%FBS 的DMEM/高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48 h 后傳代得到心肌成纖維細(xì)胞。未貼壁的心肌細(xì)胞直接以5 ×103個(gè)/孔和1 × 105個(gè)/孔的濃度分別接種于12 孔板和6 孔板中，48 h 后更換培養(yǎng)基并觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)情況。

1.3 心肌重構(gòu)細(xì)胞模型的建立及AST 干預(yù)本部分實(shí)驗(yàn)共設(shè)3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即Blank 對(duì)照組，AngII 誘導(dǎo)組及AST 干預(yù)組。將心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，更換FBS-free DMEM/高糖培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h以進(jìn)行同步化。同步化后，Blank組細(xì)胞更換新的FBS-free DMEM/高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，AngII 組細(xì)胞使用含有10-6mol/L AngII 的FBSfree DMEM/高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心肌成纖維細(xì)胞活化，AST 干預(yù)組細(xì)胞先使用含有100 μmol/LAST 的FBS-free DMEM/高糖培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞90 min，預(yù)處理結(jié)束后，更換含有10-6mol/L AngII 和100 μmol/L AST 的FBS-free DMEM/高糖培養(yǎng)基。12 孔板細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后提取RNA 以檢測(cè)相關(guān)因子的表達(dá)水平，6 孔板細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后提取蛋白以檢測(cè)Wnt 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-Catenin 的表達(dá)水平。

1.4 心肌細(xì)胞鬼筆環(huán)肽染色培養(yǎng)心原代肌細(xì)胞48 h 后，按1.3 描述的方法使用AngII 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大并使用AST 進(jìn)行干預(yù)。AST 干預(yù)48 h 后，棄去培養(yǎng)基并使用37 ℃預(yù)熱的PBS 清洗貼壁細(xì)胞2 次。每孔加入3.7%的多聚甲醛200 μL 室溫固定心肌細(xì)胞10 min，固定完成后使用PBS 洗滌心肌細(xì)胞2 次。棄掉培養(yǎng)板中的PBS，每孔加入200 μL 熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色劑，室溫避光反應(yīng)20 min。染色完成后，DAPI 封片并在熒光顯微鏡下觀察和拍照，使用Image J 軟件檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)因子的表達(dá)水平設(shè)計(jì)和合成用于檢測(cè)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞中α-SMA、Col1α1、Col3α1、ANP、BNP、TGF-β、Wnt-1、Wnt-3α、fz2、Dvl1、Dvl2 表達(dá)水平的上、下游引物，利用Real-time PCR 檢測(cè)上述因子的表達(dá)水平。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用Quante Studio Soft 1.3 軟件通過2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 Western Blot 檢測(cè)使用Western Blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞中Wnt 信號(hào)關(guān)鍵蛋白β-Catenin 及成纖維細(xì)胞中α-SMA、Col1α1 及Col3α1 的表達(dá)水平。Western Blot實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)文獻(xiàn)記錄的方法進(jìn)行［14］。使用10%的分離膠和濃縮膠對(duì)蛋白進(jìn)行電泳，電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，80 min。轉(zhuǎn)膜完成后，切下含有目的條帶NC 膜，使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉完成后，將抗體加入到含有相應(yīng)目的條帶的孵育盒中，4 ℃孵育過夜，抗體的稀釋倍數(shù)為1 000，抗體稀釋液為TBST。一抗孵育完成后，TBST 清洗NC 膜3 次，每次5 min。加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h后進(jìn)行顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用± s 表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間比較采用SNK 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大具有顯著的保護(hù)作用10-6mol/L AngII 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞24 h后，AngII 誘導(dǎo)組細(xì)胞ANP 和BNP 的表達(dá)水平分別是正常心肌細(xì)胞的2.4 倍和3.1 倍，而兩者在AST干預(yù)組心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平分別是正常心肌細(xì)胞的1.23 倍和1.36 倍，組間比較具有顯著差異（P ＜0.05，圖1A）。心肌細(xì)胞鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，AngII 誘導(dǎo)組心肌細(xì)胞的表面積是正常心肌細(xì)胞的2.5倍，而AST 干預(yù)組心肌細(xì)胞的表面積是正常心肌細(xì)胞的1.13 倍，組間比較具有顯著性差異（P ＜0.05，圖1B）。上述結(jié)果說明，AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大具有顯著的保護(hù)作用。

圖1 AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用Fig.1 Protective effect of AST on AngII-induced cardiomyocyte hypertrophy

2.2 AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞活化具有顯著的保護(hù)作用qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，AngII誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞24 h 后，α-SMA、Col1α1 和Col3α1 在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著增加，其相對(duì)表達(dá)量分別是正常心肌成纖維細(xì)胞的3.25 倍、2.17 倍及2.2 倍，而AST 干預(yù)組心肌細(xì)胞中三者的相對(duì)表達(dá)水平分別是正常心肌細(xì)胞的1.31 倍、1.23 倍及1.05 倍，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05，圖2A），相似的結(jié)果也被Western Blot 檢測(cè)所證實(shí)（P ＜0.05，圖2B）。上述結(jié)果說明，AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和活化具有顯著的抑制作用。

圖2 AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞活化的保護(hù)作用Fig.2 Protective effect of AST on AngII-induced fibroblast activation

2.3 AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的Wnt 信號(hào)在心肌細(xì)胞中的活化和TGF-β在心肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)具有顯著地抑制作用qPCR 結(jié)果顯示，AngII 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞24 h 后，Wnt-1、Wnt-3α、fz2、Dvl1 和Dvl2 在心肌細(xì)胞及TGF-β在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著增加，而AST 對(duì)此有顯著地抑制作用（P ＜0.05，圖3A、B）。Western blot 結(jié)果顯示，AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的β-Catenin 在心肌細(xì)胞中的表達(dá)具有顯著的抑制作用（P ＜0.05，圖3B、C）。上述結(jié)果說明，AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用與其抑制Wnt 信號(hào)活化有關(guān)，而AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化的保護(hù)作用與其抑制TGF-β表達(dá)有關(guān)。

圖3 AST 對(duì)Wnt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白在心肌細(xì)胞中的表達(dá)和TGF-β 在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)具有顯著地抑制作用Fig.3 inhibitive effect of AST on expression level of Wnt related protein in cardiomyocyte and TGF-β in Fibroblasts

3 討論

本研究初步在體外驗(yàn)證了AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)心肌重構(gòu)的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和心肌成纖維細(xì)胞的活化具有顯著的抑制作用，這與其抑制AngII 誘導(dǎo)的Wnt 信號(hào)在心肌細(xì)胞中的活化和TGF-β在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)。

A 型心房鈉尿肽（ANP）和B 型尿鈉肽（BNP）是一種由心房合成、貯存和分泌的活性多肽，具有強(qiáng)大的利鈉、舒張血管、降低血壓和對(duì)抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)和抗利尿激素作用。當(dāng)心臟壓力負(fù)荷和容量負(fù)荷增加時(shí)，心房會(huì)反射性的合成和分泌ANP 和BNP 以減輕前、后負(fù)荷和改善心功能。因此，ANP 和BNP 常作為判斷心功能是否受損的標(biāo)志物在很多心肌重構(gòu)相關(guān)的研究中被檢測(cè)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，在10-6mol/L AngII 刺激心肌細(xì)胞24 h后，ANP 和BNP 的表達(dá)水平顯著增加，而AST 對(duì)此有顯著的抑制作用，說明AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。此外，在長(zhǎng)期的機(jī)械壓力和其它病理因素刺激下，心臟成纖維細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后，其增殖活性、α-SMA 和膠原合成能力顯著增加，大量的膠原堆積在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）而影響心臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。因此，本研究檢測(cè)的成纖維細(xì)胞α-SMA、col1α1 和col3α1 表達(dá)水平常作為病理?xiàng)l件下成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志物，而AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的活化具有顯著的抑制作用［16］。

Wnt 信號(hào)在心肌發(fā)育和病理性心肌重構(gòu)的發(fā)生過程中扮演重要的角色，特別是經(jīng)典的Wnt/GSK-3β/β-Catenin 通路已被證實(shí)參與多種病因誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)［17］。Wnt 是一種分泌型脂質(zhì)修飾的糖蛋白，其能夠與細(xì)胞表面受體Frz receptor 結(jié)合，通過經(jīng)典的Wnt 途徑和非經(jīng)典的Wnt 途徑調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的發(fā)育和肥大反應(yīng)。β-Catenin 是細(xì)胞中重要的鈣離子依賴型第二信使，胞質(zhì)中的β-Catenin常與其它蛋白相互作用形成復(fù)合物及被磷酸化失去穩(wěn)定性而被降解［18］。當(dāng)Wnt 分泌增加時(shí)，其與細(xì)胞表面受體相互作用后將活化GSK-3β，活化的GSK-3β將抑制β-Catenin 復(fù)合物的形成和磷酸化而穩(wěn)定β-Catenin，非磷酸化的β-Catenin 進(jìn)入細(xì)胞核作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子促進(jìn)多種與心肌重構(gòu)有關(guān)的基因表達(dá)［19］。在本研究中，AngII 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞24 h 后，Wnt 信號(hào)相關(guān)蛋白Wnt-1、Wnt-3α、fz2、Dvl1 和Dvl2 表達(dá)水平顯著增加，而AST 對(duì)此有顯著的抑制作用，說明AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Wnt 信號(hào)的活化具有顯著的抑制作用。

TGF-β信號(hào)通路在AngII 和壓力誘導(dǎo)的病理性心肌纖維化中扮演重要的角色。研究顯示，TGF-β能夠通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)心肌的纖維化和與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)［20-21］。體外研究顯示，TGF-β能夠通過抑制MMP 的表達(dá)及促進(jìn)MMP抑制基因的表達(dá)直接誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積［22］。β-Catenin 作為是TGF-β信號(hào)的重要下游因子，其能夠有效地調(diào)節(jié)膠原和其他ECM 的表達(dá)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，AST 對(duì)AngII 誘導(dǎo)的TGF-β在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)具有顯著的抑制作用，這可能是其保護(hù)心肌纖維化的重要機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，AST 在體外對(duì)AngII 誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)具有顯著的保護(hù)作用，但體外研究與體內(nèi)研究尚存在很大的差異。因此，下一步將在動(dòng)物水平驗(yàn)證AST 對(duì)心肌重構(gòu)的保護(hù)作用并通過心肌組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ふ褹ST 保護(hù)心肌重構(gòu)的干預(yù)靶點(diǎn)。