法舒地爾與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共育液對(duì)大鼠脊髓損傷后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

詹吉恒 肖方駿 羅丹 侯宇， 林定坤

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510405）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科（廣州510120）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱?？频奈Ｖ匕Y之一，具有較高的致殘率。其病理機(jī)制以繼發(fā)性損傷中的神經(jīng)元凋亡以及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷等為主［1］，而SCI 后積極的抗炎、抗氧化治療，不僅能保護(hù)殘存的神經(jīng)元細(xì)胞，還能促進(jìn)肢體功能的恢復(fù)［2］。既往研究多采用單種藥物進(jìn)行干預(yù)，但其收效甚微［3-4］，因此尋找一種新的治療方式以糾正SCI 后機(jī)體的炎癥和氧化應(yīng)激水平是目前治療的關(guān)鍵。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有高效的自我更新和增殖能力，同時(shí)能分泌細(xì)胞因子以調(diào)控內(nèi)環(huán)境，故常被用作移植細(xì)胞治療SCI［5］。但大量的研究發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞雖成功到達(dá)目標(biāo)區(qū)域，脊髓傷區(qū)卻未得到有效修復(fù)，多數(shù)學(xué)者推測(cè)可能是受傷區(qū)局部氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的影響。法舒地爾（fasudil，F(xiàn)AS）不僅是臨床常用的血管擴(kuò)張藥物，還對(duì)多種臟器具有保護(hù)作用，該現(xiàn)象與其緩解氧化應(yīng)激并降低炎癥反應(yīng)的活性產(chǎn)物釋放密切相關(guān)［6］。因此筆者推測(cè)使用FAS 處理BMSCs 可能提高后者在SCI 大鼠體內(nèi)的活性，并調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)。為此，本課題組通過(guò)體外研究FAS 對(duì)BMSCs 活性的影響，并建立動(dòng)物模型，以觀察FAS 與BMSCs 共育液對(duì)SCI 大鼠的治療作用及可能的機(jī)制，為后期運(yùn)用干細(xì)胞移植治療SCI提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)3 周齡雌性SD 大鼠4 只，用于提取BMSCs；SPF 級(jí)3月齡雌性SD 大鼠40 只，用于建立脊髓損傷動(dòng)物模型。動(dòng)物均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由攝水飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司），大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（Cyagen 公司），虎杖苷（Sigma 公司），CCK-8 試劑盒（碧云天公司），iNOS 多克隆抗體、GADPH 抗體（Abcam 公司），NF-κB 多克隆抗體（NOVUS 公司），IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（酶聯(lián)生物公司），SOD、MDA 試劑盒（南京建成公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司），倒置相差顯微鏡（Leica 公司），電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司），PCI-3000 精密大小鼠脊髓損傷撞擊器（Hatteras Instruments 公司）。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs 的培養(yǎng)與鑒定取3 周齡SD 大鼠，以全骨髓貼壁法提取原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)貼壁細(xì)胞融合度達(dá)90%即可按1∶3 比例傳代。取第3 代細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，分別取3×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行CD44-PE、CD34-PE 染色，并設(shè)立同型陰性對(duì)照，PBS 清洗后4 ℃避光孵育二抗30 min，細(xì)胞重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。

1.3.2 CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)取第3 代細(xì)胞，按1×104/孔接種于96 孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度FAS（3、10、30、100 μmol/L）干預(yù)24 h，各有5 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)結(jié)束后于每孔加入10 μL CCK-8 溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h 后，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)吸光值，并計(jì)算各組細(xì)胞活性。

1.3.3 動(dòng)物分組及脊髓損傷模型建立3月齡SD大鼠隨機(jī)分為4 組：假手術(shù)組、模型組、BMSCs 組、BMSCs+FAS 組，每組10 只。麻醉成功后，逐層暴露，咬除T8-T10 椎板，顯露脊髓。參照改良Allen′s法，以10.0 g、0.8 mm/s 的致傷速率打擊T9節(jié)段脊髓，以大鼠身體發(fā)生一過(guò)性顫抖、雙下肢迅速回縮并揮動(dòng)、尾巴來(lái)回?cái)[動(dòng)為模型制備成功的標(biāo)志。術(shù)后連續(xù)3 d 肌注青霉素預(yù)防感染，每日2 次按摩膀胱進(jìn)行人工排尿，直至大鼠恢復(fù)自主排尿功能。

1.3.4 給藥方法于術(shù)后第1、3、5天通過(guò)尾靜脈注射對(duì)各組大鼠進(jìn)行干預(yù)。BMSCs 組：細(xì)胞消化后離心，重懸吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×106/mL，取1 mL 用于尾靜脈移植；BMSCs+FAS 組：按照前期研究結(jié)果，移植30 μmol/L FAS 與BMSCs 共育液，細(xì)胞密度同BMSCs 組。假手術(shù)組和模型組注射等體積生理鹽水。

1.3.5 抗氧化酶系統(tǒng)活性測(cè)定術(shù)后1 周取傷區(qū)脊髓組織，勻漿后離心并取上清，稀釋至1%濃度，以化學(xué)比色法測(cè)定脊髓組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，具體步驟按南京建成公司提供的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.6 炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α測(cè)定脊髓組織中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量使用ELISA 法檢測(cè)。將脊髓組織勻漿，提取蛋白后進(jìn)行濃度測(cè)定。上樣后于37 ℃孵育30 min，洗滌后加入酶標(biāo)試劑繼續(xù)作用30 min，最后加入顯影劑并檢測(cè)吸光值，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書計(jì)算各炎癥因子表達(dá)量。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)脊髓組織iNOS、NF-κB蛋白表達(dá)裂解脊髓組織，提取總蛋白，BCA 法定量后使蛋白變性。于10% SDS 電泳中分離并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，4 ℃孵 育 一 抗iNOS（1∶1000）、NF-κB（1∶1 000）和GADPH（1∶2 000）過(guò)夜，TBST 洗膜后再加入對(duì)應(yīng)HRP 標(biāo)記二抗室溫孵育90 min，ECL 顯影。以GADPH 為內(nèi)參，用ImageJ 軟件計(jì)算目的條帶灰度值。

1.3.8 下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分將大鼠在術(shù)后第1、7、14、21、30 天置于曠場(chǎng)中自由活動(dòng)5 min，根據(jù)Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分評(píng)價(jià)各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)能力。最大值為21 分，0 分表示完全癱瘓，21 分表示正常。每只大鼠均評(píng)定3 次，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以± s 表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 的形態(tài)提取的大鼠BMSCs 以靜態(tài)貼壁形式生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)可純化，呈形態(tài)規(guī)則、大小均一的梭形，第3 代細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d 可達(dá)80%融合度（圖1A）。

2.2 BMSCs 的流式細(xì)胞術(shù)鑒定流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，CD44 表達(dá)陽(yáng)性（95.1%），CD34 表達(dá)陰性（0.8%），證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為大鼠BMSCs（圖1B～D）。

2.3 FAS 對(duì)BMSCs 活性的影響如圖2 所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)AS 在3 μmol/L 濃度時(shí)對(duì)BMSCs 的活性沒(méi)有顯著影響（P ＞0.05），10、30 μmol/L 的FAS 可提高BMSCs 的活性，其中30 μmol/L 時(shí)細(xì)胞活性最佳（P ＜0.05），而100 μmol/L FAS 對(duì)BMSCs活性有一定抑制作用，故選用30 μmol/L FAS 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 FAS 干預(yù)對(duì)BMSCs 細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of FAS on the viability of BMSCs

2.4 BBB 評(píng)分術(shù)后BBB 評(píng)分結(jié)果顯示，除假手術(shù)組外，其余組別大鼠均明顯降低，但3 組間BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。與模型組比較，在術(shù)后第14、21 和30 天，BMSCs 組及BMSCs +FAS 組大鼠BBB 評(píng)分均出現(xiàn)不同程度改善（P ＜0.05）。術(shù)后30 d，BMSCs+FAS 組大鼠BBB 評(píng)分改善幅度優(yōu)于BMSCs 組（P ＜0.05，表1）。

2.5 FAS 對(duì)SCI 大鼠脊髓組織中氧自由基的影響大鼠造模后，脊髓組織SOD 活力下降，MDA含量增加，iNOS 蛋白表達(dá)上升（P ＜0.05）。經(jīng)干預(yù)后，BMSCs 組與BMSCs+FAS 組脊髓組織的SOD活力明顯高于模型組（P ＜0.05），而MDA 含量及iNOS 蛋白表達(dá)則低于模型組（P ＜0.05），其中BMSCs+FAS 組iNOS 蛋白表達(dá)較BMSCs 組更低（P ＜0.05）（圖3、圖4A ～B）。

圖3 各組脊髓組織中SOD 活力及MDA 水平Fig.3 SOD activity and MDA content in spinal cord tissues of each group

2.6 FAS 對(duì)SCI 大鼠脊髓中炎癥因子含量的影響造模后，SCI 大鼠脊髓中炎癥因子含量均顯著升高（P ＜0.05）。與模型組比較，BMSCs 組和BMSCs+FAS 組經(jīng)干預(yù)后脊髓中IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB含量均減少（P ＜0.05）。其中BMSCs+FAS 組大鼠脊髓中NF-κB 蛋白表達(dá)比BMSCs 組更低（P ＜0.05），但兩組間炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A～C、圖5）。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)BBB 評(píng)分Tab.1 BBB scores of each group at different time points after surgery ±s

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)BBB 評(píng)分Tab.1 BBB scores of each group at different time points after surgery ±s

注：與模型組相比，*P ＜0.05；與BMSCs 組相比，△P ＜0.05

組別假手術(shù)組模型組BMSCs組BMSCs+FAS組術(shù)后1 d 21.0±0.00 1.2±0.84 1.4±0.55 1.3±0.45術(shù)后7 d 21.0±0.00 3.4±1.34 4.4±1.52 4.6±0.89術(shù)后14 d 21.0±0.00 4.6±1.14 7.6±1.14*7.8±1.30*術(shù)后21 d 21.0±0.00 5.6±0.89 8.4±0.55*9.4±1.82*術(shù)后30 d 21.0±0.00 6.6±1.52 9.6±0.89*11.4±1.52*△

圖4 Western blot 法檢測(cè)脊髓組織中iNOS、NF-κB 的蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of iNOS,NF-κB protein detected by Western blot

圖5 ELISA 檢測(cè)各組脊髓組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量Fig.5 ELISA results for IL-1β，IL-6，and TNF-α in spinal cord tissues of each group

3 討論

3.1 氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)在SCI 病理過(guò)程中的影響SCI 后氧自由基和炎癥因子水平有明顯的上調(diào)趨勢(shì)，表明繼發(fā)性損傷的發(fā)生。SCI 的已知效應(yīng)之一是鈣離子活化和活性氧的產(chǎn)生及其下游效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞等大分子的氧化損傷，SOD 活力降低，體內(nèi)氧自由基等產(chǎn)物堆積，氧化還原水平失衡，伴隨之iNOS 表達(dá)上升［7］。其中脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化損傷是SCI 氧化應(yīng)激的重要因素，當(dāng)脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸被活性氧簇攻擊時(shí)即生成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，而MDA 又能加劇神經(jīng)元胞膜的損傷［8］。因此可以通過(guò)了解SOD 活力、MDA 含量及iNOS 表達(dá)評(píng)估氧化應(yīng)激程度［9］。炎癥反應(yīng)作為繼發(fā)性損傷的主要介質(zhì)，在SCI 的發(fā)病過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液中的固有免疫細(xì)胞會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，隨著病情發(fā)展，上述級(jí)聯(lián)事件持續(xù)惡化并導(dǎo)致慢性炎癥，引起細(xì)胞凋亡、壞死以及自噬［10］。據(jù)報(bào)道，與SCI有關(guān)的炎癥相關(guān)因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α及其介質(zhì)NF-κB，均被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)損傷的重要因素［11］。由于以氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為主的繼發(fā)性損傷會(huì)造成疾病進(jìn)一步惡化，因此在該節(jié)點(diǎn)上進(jìn)行有效干預(yù)作為一種保護(hù)策略具有重大意義。

3.2 FAS與BMSCs共育液治療SCI外源性BMSCs移植治療SCI 由來(lái)已久，BMSCs 通過(guò)遷移，到達(dá)并整合至脊髓傷區(qū)中，借由旁分泌機(jī)制合成并分泌一系列生物活性物質(zhì)，對(duì)微環(huán)境具有積極的調(diào)控作用［12］。王亮等［13］用該方法治療SCI 大鼠模型，結(jié)果顯示，BMSCs 組大鼠的脊髓組織勻漿中NF-κB、p65、IL-1β和TNF-α的水平明顯低于模型組，并認(rèn)為這可能是通過(guò)抑制TLR4 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)減少脊髓組織中炎癥反應(yīng)。卜志勇等［14］在類似的研究中也發(fā)現(xiàn)移植BMSCs 能有效調(diào)控抗氧化酶系統(tǒng)活性。本研究結(jié)果表明，SCI 大鼠急性期脊髓組織SOD 活性降低，而MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及iNOS、NF-κB 的蛋白表達(dá)均增加，上述指標(biāo)在兩個(gè)治療組中均有所改善，其中BMSCs+FAS組改善幅度最明顯，并表現(xiàn)出更好的后肢運(yùn)動(dòng)功能。表明FAS 與BMSCs 共育液可有效減輕SCI 大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并發(fā)揮治療作用。

3.3 FAS 與BMSCs 的關(guān)系徐小隔等［15］采用FAS 干預(yù)大鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs 胞體收縮成球形，并伸出較多細(xì)長(zhǎng)突起，且隨時(shí)間正向上調(diào)NSE和MAP-2 基因表達(dá)。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FAS 預(yù)處理后的BMSCs 能更多地經(jīng)由尾靜脈遷移至脊髓傷區(qū)，且該促遷移現(xiàn)象能維持3 周以上［16］。本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS 在30 μmol/L 時(shí)細(xì)胞活性最佳，而100 μmol/L 的FAS 對(duì)BMSCs 活性有一定抑制作用。此外，F(xiàn)AS 還能活化Nrf2 及其下游的基因，而該現(xiàn)象被證實(shí)與抗氧化活性及抗炎能力成正相關(guān)［17］。上述研究結(jié)果表明FAS 對(duì)大鼠BMSCs具有促神經(jīng)元樣細(xì)胞分化、促遷移及提高其活性的作用，共同為FAS 聯(lián)合BMSCs 移植治療SCI 提供了有力的理論支持。

綜上所述，F(xiàn)AS 與BMSCs 共育液移植治療對(duì)SCI 大鼠急性期具有積極的保護(hù)作用，并有利于后期肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，這種作用可能是基于其降低脊髓傷區(qū)活性氧簇水平，提高機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的活性，并減少炎癥因子的釋放。本研究為SCI的臨床藥物靶點(diǎn)治療提供了重要線索，也為FAS的開(kāi)發(fā)運(yùn)用提供了方向，但內(nèi)在的分子作用機(jī)制及調(diào)控通路仍有待進(jìn)一步研究以明確。