核桃分離蛋白的制備及其包埋番茄紅素的工藝

龐志花，郭倩，徐若琳，李赫，劉新旗

北京工商大學(xué)，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心（北京 100048）

核桃（Juglans regia L.）別名胡桃、羌果，屬胡桃科胡桃屬植物，是一種兼具高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的名貴果木。在我國(guó)，核桃的培育歷史悠久，分布面積廣泛。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2012年中國(guó)核桃年產(chǎn)量占世界年產(chǎn)量的49.73%，達(dá)170萬 t，居世界第一[1]。然而目前核桃主要是用于榨油，其副產(chǎn)物餅粕中蛋白質(zhì)含量達(dá)55%，深加工程度太低，大部分用于飼料，產(chǎn)品附加值太低[2]，浪費(fèi)了寶貴的核桃蛋白資源。

有研究表明核桃蛋白在堿性條件下乳化性和溶解性均較好，而在pH 5.0左右溶解度迅速下降[3]。試驗(yàn)擬根據(jù)這一特征，以pH為關(guān)鍵工藝條件，開發(fā)以核桃蛋白為壁材的脂溶性活性成分的微膠囊；近些年植物蛋白因其資源充足、功能性好，已經(jīng)成為備受關(guān)注的包埋壁材[4]，但尚未見核桃蛋白作為壁材的相關(guān)研究報(bào)道。番茄紅素在光照、熱源和氧存在的環(huán)境條件下都極不穩(wěn)定[5]，較大限制了其應(yīng)用，目前微膠囊研發(fā)成為提高番茄紅素穩(wěn)定性的核心技術(shù)[6]。因此，以核桃蛋白作為包埋壁材，包埋番茄紅素，探索其包埋效果，以期為核桃蛋白的應(yīng)用提出新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃粉（香玲核桃和雞爪棉核桃的混合粉，購(gòu)自山東東創(chuàng)食品有限公司）；金龍魚大豆油（嘉里食品有限公司）；番茄紅素（油樹脂形式，番茄紅素含量6.4%，中糧屯河股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃分離蛋白的制備及成分分析[7]

1.2.1.1 核桃蛋白的制備

制備核桃脫脂粉，將核桃粉和正己烷以1︰10（g/mL）的比例混合，常溫下置于磁力攪拌器，攪拌3 h，抽濾所得濾渣，和正己烷以1︰5（g/mL）的比例混合，攪拌1 h，所得濾渣放置于通風(fēng)櫥，揮發(fā)有機(jī)試劑以得到脫脂粉。將核桃脫脂粉和水按1︰20（g/mL）的比例混合，調(diào)整pH 11，并于常溫?cái)嚢? h后，以10 000 r/min離心25 min，所得上清液調(diào)整pH 4.5，在4 ℃靜置1.5 h，離心收集沉淀。調(diào)整沉淀pH 7，透析，真空冷凍干燥即得到核桃蛋白粉。分別參照GB 5009.5—2010、GB/T 14772—2008、GB 5009.3—2010和GB 5009.4—2010的方法測(cè)定所得核桃蛋白中的蛋白質(zhì)、脂肪、水分和灰分。

核桃分離蛋白的提取率按式（1）計(jì)算。

式中：Y表示提取率，%；m1表示核桃脫脂粉質(zhì)量，g；m2表示冷凍干燥后核桃分離蛋白質(zhì)量，g。

1.2.2 核桃蛋白包埋番茄紅素的工藝研究

1.2.2.1 番茄紅素微膠囊的制備工藝[8]

配制4%核桃分離蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH 11，于50 ℃水浴攪拌使核桃分離蛋白充分溶解，加入0.5%單甘酯，即為水相。在避光條件下，將稱取的番茄紅素油樹脂用適量的乙酸乙酯溶解，再加入體積分?jǐn)?shù)為15%的大豆油，均質(zhì)2 min，即為油相。將油相按照所需比例緩慢加入到水相中，攪拌并均質(zhì)2 min（9 000 r/min，如無其他說明）。為使得芯壁材料充分接觸，在設(shè)定溫度（50 ℃，如無其他說明）包埋反應(yīng)一定時(shí)間（50 min，如無其他說明）。溫度降至室溫，調(diào)節(jié)體系pH至4.5，離心得沉淀，真空冷凍干燥即得微膠囊粉末。

1.2.2.2 核桃分離蛋白包埋番茄紅素的包埋效率的測(cè)定

利用紫外分光光度法，在474 nm處測(cè)定吸光度，繪制番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線；稱取0.2 g微膠囊于50 mL具塞試管中，直接加入萃取液萃取微膠囊表面番茄紅素，用于測(cè)定包埋表量；試管中首先加入適量堿性蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH 8，于50 ℃水浴酶解核桃蛋白壁材，加入萃取液萃取番茄紅素，用于測(cè)定包埋總量；將有機(jī)相定容至50 mL，于474 nm處測(cè)定吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算番茄紅素含量。微膠囊化的效果評(píng)定采用微膠囊化效率和產(chǎn)率2個(gè)指標(biāo)。微膠囊化的效率和產(chǎn)率按式（2）和（3）計(jì)算。

1.2.2.3 微膠囊工藝基本參數(shù)的確定

根據(jù)包埋效率和產(chǎn)率確定最佳芯壁比，分別確定參數(shù)。

1.2.2.3.1 芯壁比

固定壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，芯壁比選取2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5這6個(gè)水平，在不添加任何乳化劑的情況下確定最佳芯壁比。

1.2.2.3.2 乳化劑

選取改性大豆磷脂（HLB=11）、蔗糖酯（HLB=13）、T-80（HLB=15）和水分散型分子蒸餾單甘酯（HLB=11～16）4種乳化劑，在芯壁比1︰2條件下評(píng)價(jià)包埋效果。

1.2.2.3.3 乳化劑添加量

在芯壁比1︰2條件下，選取0.25%，0.50%和1.00%這3個(gè)水平添加選定的乳化劑，評(píng)價(jià)包埋效果。

1.2.2.4 微膠囊制備的工藝優(yōu)化

1.2.2.4.1 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)分別考察均質(zhì)剪切速率（6 000～16 000 r/min）、包埋溫度（40～80 ℃）、包埋時(shí)間（25～70 min）對(duì)微膠囊化效果的影響。

1.2.2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用L9(34)正交表對(duì)均質(zhì)機(jī)剪切速率、包埋溫度和包埋時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以微膠囊化效率和產(chǎn)率作為考察指標(biāo)。

1.2.2.5 微膠囊化番茄紅素的穩(wěn)定性的測(cè)定

分別將未包埋和包埋的番茄紅素裝入透光的無色試劑瓶中，封口，在室溫條件下置于LED仿太陽光燈（18 W，佛山市錦昊光電科技有限公司）下照射，照射的垂直高度20 cm；每隔一段時(shí)間測(cè)定番茄紅素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 核桃蛋白基本組成成分分析

試驗(yàn)得出，核桃分離蛋白提取率為67.54%。核桃粉、核桃脫脂粉和核桃分離蛋白的主要成分見表1。結(jié)果顯示，和核桃粉相比，核桃脫脂粉脂肪含量降至3.32%，蛋白質(zhì)含量為13.51%，其中碳水化合物含量最高，為72.47%。試驗(yàn)提取的核桃分離蛋白，其蛋白質(zhì)含量達(dá)到86.64%，脂肪含量降至0.53%，碳水化合物含量降至7.36%。

表1 核桃粉、核桃脫脂粉和分離蛋白的主要成分 %

2.2 核桃分離蛋白包埋番茄紅素的工藝確定

2.2.1 芯壁比的選擇

隨著壁材比例升高，包埋效率逐步提高，1︰2時(shí)包埋效率達(dá)到最高，為44.31%，隨著芯材比例繼續(xù)增加，包埋效率下降（圖1）。當(dāng)芯壁比大于1︰2時(shí)，芯材用量增加會(huì)導(dǎo)致大量芯材吸附于壁材表面，番茄紅素的微膠囊表量值很高，包埋效率降低；當(dāng)芯壁比小于1︰2時(shí)，核桃分離蛋白濃度太高可能會(huì)導(dǎo)致微膠囊液滴較大，導(dǎo)致乳液的不穩(wěn)定，包埋效果較差[9]。所以芯材或壁材比例過高，均會(huì)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)所需的壁材或芯材量少，均不利于包埋，導(dǎo)致包埋效率下降。芯壁比對(duì)包埋產(chǎn)率也有一定影響，隨著壁材比例的提高，包埋產(chǎn)率呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，這可能是一部分番茄紅素吸附于溶解性較高的核桃分離蛋白，隨離心分離損失導(dǎo)致。

圖1 芯壁比對(duì)微膠囊包埋效果的影響

2.2.2 乳化劑種類和添加量的確定

對(duì)添加不同乳化劑制得的微膠囊的包埋效率和產(chǎn)率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2（A）所示。添加單甘酯的包埋效果最好，微膠囊化效率和產(chǎn)率分別為59.8%和70.8%。進(jìn)一步對(duì)單甘酯的添加量進(jìn)行研究，選取0.25%，0.50%和1.00%這3個(gè)水平，考察微膠囊包埋效果和產(chǎn)率。從圖2（B）可以看出，單甘酯的添加可大幅提高包埋效率，超過0.5%時(shí)，其對(duì)包埋效率的影響較小，故選擇0.5%為該乳化劑的最佳使用量。

圖2 乳化劑種類和添加量對(duì)微膠囊包埋效果的影響

2.3 微膠囊包埋的工藝條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

2.3.1.1 均質(zhì)剪切速率

由圖3可知，當(dāng)剪切速率為9 000 r/min時(shí)，包埋效果最好，效率和產(chǎn)率分別為69.4%和81.33%。包埋效率及產(chǎn)率均隨著剪切速率的提高而逐步提高，在9 000 r/min時(shí)同時(shí)達(dá)到最高，此后隨著剪切速率的繼續(xù)提高，包埋效率和產(chǎn)率均呈下降趨勢(shì)。剪切速率的提高可增強(qiáng)乳液均一性和穩(wěn)定性，從而提高包埋效果；而當(dāng)剪切速率超過某一臨界值時(shí)，液滴會(huì)破乳上浮，發(fā)生乳液分層現(xiàn)象，致使包埋效果有所下降。

圖3 剪切速率對(duì)微膠囊包埋效果的影響

2.3.1.2 包埋溫度

由圖4可以看出，隨著包埋溫度的升高，包埋效率和產(chǎn)率均提高，在50 ℃時(shí)包埋效率和產(chǎn)率均達(dá)到最高，分別為67.27%和74.20%。此后隨著包埋溫度的繼續(xù)升高，效率和產(chǎn)率均逐漸下降。這是由于溫度較低，核桃分離蛋白和番茄紅素油樹脂的溶解性較差，不利于包埋；隨著溫度的升高，二者的溶解性均有所提高，使得包埋效果提高；當(dāng)超出最適溫度時(shí)，高溫乳液的乳化穩(wěn)定性變差，不利于包埋而導(dǎo)致效果下降。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)微膠囊包埋效果的影響

2.3.1.3 包埋時(shí)間

由圖5可以看出，包埋效率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步提高，在45～55 min范圍內(nèi)包埋效率較高，當(dāng)包埋時(shí)間為45 min左右時(shí)，包埋效率為69.57%；當(dāng)包埋時(shí)間為50 min時(shí)，包埋產(chǎn)率最高，為76.55%。故選定50 min為最佳包埋時(shí)間。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微膠囊包埋效果的影響

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，當(dāng)以包埋效率為指標(biāo)時(shí)，根據(jù)極差大小，各因素作用主次順序?yàn)榧羟兴俾剩景駵囟龋景駮r(shí)間。由表3可以看出，當(dāng)置信水平a=0.05，F(xiàn)比（A）＞F0.05，F(xiàn)比（B）＞F0.05時(shí)，剪切速率和包埋溫度對(duì)包埋效率均有顯著性影響，而包埋時(shí)間對(duì)效率影響不顯著。綜合直觀分析與方差分析，確定包埋工藝的最優(yōu)組合：剪切速率9 000 r/min、包埋溫度50 ℃、包埋時(shí)間45 min。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，包埋效率為67.94%，對(duì)比Li等[9]以類似方法研究的大豆蛋白包埋番茄紅素油樹脂制備的微膠囊，接近其包埋效率69.25%。當(dāng)以包埋產(chǎn)率為指標(biāo)時(shí)，根據(jù)極差大小，各因素作用主次順序?yàn)榧羟兴俾剩景駵囟龋景駮r(shí)間（表2）。置信水平a=0.05，F(xiàn)A＞F0.05，說明剪切速率對(duì)包埋產(chǎn)率有顯著性影響，包埋溫度和包埋時(shí)間對(duì)效率影響均不顯著（表3）。綜合直觀分析與方差分析，確定包埋工藝的最優(yōu)組合為A2B2C3，即剪切速率9 000 r/min、包埋溫度50 ℃、包埋時(shí)間50 min。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，包埋產(chǎn)率為80.6%。

表2 番茄紅素微膠囊制備工藝正交試驗(yàn)表

表3 方差分析表

2.3.3 微膠囊產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究

番茄紅素在光照、熱源和氧存在的環(huán)境條件下都極不穩(wěn)定[4]，其中光照是關(guān)鍵因素，較大限制了其應(yīng)用，試驗(yàn)初步評(píng)價(jià)核桃分離蛋白作為壁材包埋番茄紅素對(duì)其光照穩(wěn)定性的影響。圖6所示為光照條件下包埋和未包埋的番茄紅素的保留率隨時(shí)間的變化情況。未包埋的番茄紅素在光照下降解速度很快，在10 min內(nèi)保留率可下降到60%左右，之后降解速率有所減慢，120 min后保留率為46%左右；微膠囊化的番茄紅素，光照穩(wěn)定性得到很大提高，包埋總量的保留率在10 min后為80%左右，之后降解速率減慢，120 min后保留率維持在70%左右。包埋番茄紅素的降解部分主要是膠囊表面的番茄紅素的降解（表量）。由圖6可以看出，表量的保留率下降速度非?？欤?0 min后其保留率僅11%左右，而差量，也就是微膠囊內(nèi)部的番茄紅素在光照時(shí)間120 min內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，降解率不到5%，表明核桃分離蛋白作為壁材對(duì)番茄紅素有著很好的保護(hù)作用，因此進(jìn)一步提高包埋效率對(duì)于提高番茄紅素的光照穩(wěn)定性有重要意義。

圖6 包埋前后番茄紅素的光照穩(wěn)定性

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)中，提取核桃中分離蛋白含量達(dá)到86.64%，提取率為67.54%。以該蛋白為壁材，以pH為關(guān)鍵工藝條件對(duì)番茄紅素進(jìn)行微膠囊化處理，通過對(duì)芯壁比、適宜乳化劑及其添加量的研究，進(jìn)一步通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察均質(zhì)剪切速率、包埋溫度和包埋時(shí)間對(duì)番茄紅素微膠囊效率和產(chǎn)率的影響作用。試驗(yàn)選定芯壁比1︰2，0.5%單甘脂為適宜乳化劑，試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果為：芯壁比1︰2、單甘酯添加量0.5%、包埋溫度50 ℃、包埋時(shí)間45 min，此時(shí)包埋效率最高，為67.94%；芯壁比1︰2、單甘酯添加量0.5%、包埋溫度50 ℃、包埋時(shí)間50 min，此時(shí)包埋產(chǎn)率最高，為80.6%。同時(shí)對(duì)包埋后番茄紅素的光照穩(wěn)定性進(jìn)行考察，研究證實(shí)核桃分離蛋白作為壁材包埋番茄紅素可有效提高番茄紅素的穩(wěn)定性，尤其是膠囊內(nèi)部番茄紅素的穩(wěn)定性，因此提高包埋效率是未來研究重點(diǎn)。