鹽酸伊立替康納米膠束制劑耐受性和藥效學(xué)評(píng)價(jià)

崔 濤，武衛(wèi)黨，慈小燕，李 薇*，郭傳敏，徐 靜，伊秀林，劉昌孝

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2天津藥物研究院新藥評(píng)價(jià)有限公司，天津 300301；3國(guó)家納米科學(xué)中心，北京 100190)

伊立替康是半合成的喜樹堿衍生物，1998年獲得FDA批準(zhǔn)用于標(biāo)準(zhǔn)化療方案失敗后的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療。是FDA繼氟尿嘧啶(5-FU)以后再次批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌一線治療的化療藥[1]。除了結(jié)直腸癌，目前伊立替康臨床還應(yīng)用于胃癌[2]、胰腺癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、宮頸癌[7]等多種腫瘤的臨床治療。臨床應(yīng)用過程中，伊立替康有許多不良反應(yīng)，如腹瀉、骨髓抑制、無力、急性膽堿能綜合征、腸道反應(yīng)等[8]。為了降低不良反應(yīng)，提高療效，開發(fā)新的制劑是一種較經(jīng)濟(jì)和周期較短的方法。由于多數(shù)實(shí)體瘤生長(zhǎng)較快，需要豐富的血液供應(yīng)，所以腫瘤組織中血管豐富，但是其血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較寬，結(jié)構(gòu)不完整，缺少肌肉層，同時(shí)腫瘤組織中還有許多血管通透性物質(zhì)的廣泛生成和交互作用[9]，腫瘤組織處淋巴回流功能不全[10]，這就使脂質(zhì)體、納米顆粒及其他大分子藥物在腫瘤組織的通透性增加，清除率降低，進(jìn)而產(chǎn)生了被動(dòng)靶向性和滯留效應(yīng)，即EPR效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect)。Greish等[11]報(bào)道,相對(duì)分子質(zhì)量大于40 kD的大分子抗腫瘤藥物能夠克服腎臟的濾過清除，從而使藥物的血漿半衰期延長(zhǎng)，有利于實(shí)現(xiàn)EPR效應(yīng)?；谶@個(gè)原理，國(guó)家納米科學(xué)中心開發(fā)了伊立替康新型納米制劑，新制劑是以聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG2000-DSPE)為包載材料制成的粒徑分布為5～20 nm的納米膠束，該新型制劑主要通過保護(hù)鹽酸伊立替康免受體內(nèi)降解酶的破壞和提高其腫瘤組織的靶向性而達(dá)到減毒增效的目的。本研究通過對(duì)鹽酸伊立替康納米膠束制劑及市售制劑最大耐受劑量(MTD)和體內(nèi)外抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)分析，探討了該制劑在毒性和抗腫瘤效果上的改善情況。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶(美國(guó)Gibco公司)；MTS一步法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)。鹽酸伊立替康注射液(商品名：Campto，批號(hào)：T07958，美國(guó)Pfizer公司)；注射用鹽酸伊立替康納米膠束(批號(hào)：20180702DM，國(guó)家納米中心)。

1.2 儀 器

Zenyth 1100多功能掃描儀(奧地利Anthos公司)；IC 1000 Countstar全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)；HFsafe生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；數(shù)顯游標(biāo)卡尺(廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司)。

1.3 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

結(jié)直腸癌細(xì)胞株COLO205、HT-29、HCT-8、SW480均購于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。BALB/c裸鼠，SPF級(jí)，體重15～20 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)及使用均在天津藥物研究院新藥評(píng)價(jià)有限公司動(dòng)物房，許可證號(hào)：SYXK(津)2016-0009，動(dòng)物試驗(yàn)方案經(jīng)過了IACUC批準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 體外細(xì)胞毒性研究

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COLO205、HT-29、HCT-8、SW480細(xì)胞，以新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升5×104個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞液加入至96孔板中，每孔100 μL，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。以培養(yǎng)基按3倍稀釋度配制1.8～1 800 μg/mL的Campto或者鹽酸伊立替康納米膠束系列濃度梯度，加入96孔板中，使藥物終濃度為0.145～415 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTS試劑30 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h，應(yīng)用熒光掃描儀在492 nm處測(cè)定每孔的吸收度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組吸收度-給藥組吸收度)/對(duì)照組吸收度×100。

2.2 BALB/c荷瘤小鼠模型構(gòu)建

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COLO205細(xì)胞，調(diào)整為每毫升1×108個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種至BALB/c裸鼠腋窩皮下，每點(diǎn)100 μL，每只動(dòng)物接種兩個(gè)點(diǎn)。成瘤后，處死小鼠將腫瘤組織取出，于無菌條件下將腫瘤組織切成1 mm3左右的組織塊，接種至新的裸鼠腋窩皮下，進(jìn)行體內(nèi)傳代。體內(nèi)傳代兩次后，選取腫瘤組織生長(zhǎng)良好(平均腫瘤體積約100 mm3)的模型動(dòng)物用于后期研究。

2.3 BALB/c荷瘤裸鼠最大耐受量(maximum tolerated dose，MTD)研究

BALB/c荷瘤裸鼠隨機(jī)分組，每組8只(雌雄各半)，尾靜脈注射給予一定濃度的Campto或者鹽酸伊立替康納米膠束溶液，空白對(duì)照組給予5%葡萄糖注射液。受試藥品的濃度設(shè)定參考前期昆明小鼠MTD實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)，以昆明小鼠對(duì)于Campto或者鹽酸伊立替康納米膠束的MTD為起始給藥劑量：①以前期所確定的正常動(dòng)物MTD按比例因子1.25增加，直至出現(xiàn)急性死亡或注射1 d后所有動(dòng)物出現(xiàn)毒性癥狀；②按比例因子0.8降低給藥劑量，直至找到不出現(xiàn)急性死亡或注射1 d后不出現(xiàn)毒性癥狀的劑量，作為初步的MTD；③給藥第2天，增加未出現(xiàn)動(dòng)物死亡組別的動(dòng)物數(shù)量(雌雄各增加1只)，給予該組別藥物。給藥后連續(xù)觀察7 d，觀察指標(biāo)包括體重、對(duì)外界刺激的反應(yīng)、進(jìn)食、排泄、被毛、呼吸、步態(tài)等，若觀察期內(nèi)不出現(xiàn)死亡、進(jìn)展的毒性癥狀及體重與給藥前相比下降15%，即可認(rèn)為該劑量為MTD，否則繼續(xù)按遞減比例的劑量進(jìn)行摸索，直至找到符合條件的MTD。

2.4 體內(nèi)藥效學(xué)研究

選取腫瘤體積100 mm3左右的荷瘤小鼠，隨機(jī)分為5組，每組8只(雌雄各半)。根據(jù)前期MTD研究結(jié)果，Campto設(shè)置兩個(gè)劑量組，分別為177.0和221.2 mg/m2；伊立替康納米膠束設(shè)置兩個(gè)劑量組，分別為276.5和345.6 mg/m2；空白對(duì)照組給予5%葡萄糖注射液。尾靜脈注射給藥，每周給藥1次，連續(xù)3周。每天觀察各組小鼠一般狀態(tài)，包括體毛、神志、活動(dòng)、飲食、飲水等。每周測(cè)量?jī)纱文[瘤體積，計(jì)算相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)，與空白對(duì)照組比較，給藥組腫瘤相對(duì)增殖率小于40%且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，視為具有抗腫瘤效果[12]；每周測(cè)量?jī)纱蝿?dòng)物體重，監(jiān)測(cè)受試藥物的毒性作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘取腫瘤，稱量腫瘤濕重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率；摘取臟器心、肝、腎，福爾馬林固定，5%硝酸脫鈣、酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包理，切片，常規(guī)HE染色觀察其病理變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 體外細(xì)胞毒性研究分析受試藥物對(duì)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用

通過體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，本研究獲得了Campto及鹽酸伊立替康納米膠束對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞COLO205、HT-29、HCT-8、SW480生長(zhǎng)抑制的IC50，結(jié)果如表1和圖1所示，兩種制劑對(duì)幾種細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制作用并無明顯差異，本研究選取抑制作用IC50最小的COLO205細(xì)胞構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)研究。

Table1 IC50of Campto and nano-micelle irinotecan on colorectal cancer cellsinvitro(n=4)

CellIC50/(μg/mL)CamptoNano-micelle irinotecanCOLO20520.7513.05HT-2921.7918.72HCT-827.3421.44SW48095.3741.95

Figure1Inhibition rate of Campto and nano-micelle irinotecan with different concentrations on four types of colorectal cancer cells (n=4)
A：COLO205;B：HT-29;C：HCT-8;D：SW480

3.2 BALB/c荷瘤裸鼠對(duì)受試藥物MTD的研究

參考前期昆明小鼠對(duì)于Campto及鹽酸伊立替康納米膠束MTD的研究，分別給予荷瘤裸鼠Campto 432.0、345.6、276.5及221.2 mg/m24個(gè)劑量，給予荷瘤裸鼠鹽酸伊立替康納米膠束540.0、432.0、345.6及276.5 mg/m24個(gè)劑量，測(cè)試荷瘤裸鼠對(duì)于Campto及鹽酸伊立替康納米膠束MTD。Campto 432.0、345.6 mg/m2劑量組及鹽酸伊立替康納米膠束540.0 mg/m2劑量組均在給藥當(dāng)天有動(dòng)物出現(xiàn)急性死亡，其他給藥組在第2天增加動(dòng)物數(shù)量至10只，給藥后連續(xù)觀察7 d，沒有發(fā)現(xiàn)動(dòng)物有明顯的毒性反應(yīng)，各給藥組與空白對(duì)照組相比也未出現(xiàn)平均體重下降的情況。由此確定COLO205荷瘤裸鼠對(duì)于Campto的MTD為276.5 mg/m2(區(qū)間范圍為276.5～345.6 mg/m2)，對(duì)于鹽酸伊立替康納米膠束的MTD為432.0 mg/m2(區(qū)間范圍為432.03～540.04 mg/m2)?？梢钥闯鳆}酸伊立替康納米膠束制劑相對(duì)于Campto來說，提高了動(dòng)物的最大耐受劑量，降低了藥物的毒性。

3.3 體內(nèi)藥效學(xué)研究

BALB/c荷瘤裸鼠給藥后，Campto及鹽酸伊立替康納米膠束給藥組腫瘤體積均明顯縮小(圖2，圖3)。給藥后第21天(表2)，各給藥組相對(duì)腫瘤增殖率均小于40%，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)各給藥組腫瘤濕重抑制率均大于80%，所以Campto及鹽酸伊立替康納米膠束各受試劑量均具有明顯的抗腫瘤效果。兩種制劑相比較，其中鹽酸伊立替康納米膠束345.6 mg/m2劑量組相對(duì)腫瘤增殖率顯著低于Campto兩個(gè)劑量組(P<0.05)，同時(shí)腫瘤生長(zhǎng)抑制率顯著高于Campto兩個(gè)劑量組(P<0.05)。由此可見，鹽酸伊立替康納米膠束制劑體內(nèi)藥效增加和給藥劑量的提高是相關(guān)的。實(shí)驗(yàn)過程中各組動(dòng)物體重?zé)o明顯降低(圖4)，一般狀態(tài)良好，無明顯毒性反應(yīng)。常規(guī)HE染色結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，各給藥組的心內(nèi)膜、外膜光滑，心肌纖維排列整齊，胞漿豐富，橫紋結(jié)構(gòu)清楚，間質(zhì)未見明顯異常；肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)清晰，匯管區(qū)及間質(zhì)未見明顯異常；皮、髓質(zhì)腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，各種細(xì)胞形態(tài)清晰，間質(zhì)未見明顯異常(圖5)。

Figure3Tumor tissue after 21 days of administration

GroupDosage/(mg/m2)(T/C)/%IRCampto177.020.56±9.34*82.40±10.34*221.215.81±4.56*89.18±4.22*Nano-micelle irinote-can276.512.18±4.8492.57±2.83*345.67.08±2.5595.71±2.25

*P<0.05vsnano-micelle irinotecan 345.6 mg/m2

Figure5Pathological observation of heart,liver and kidney of mouse in each group (×10)

4 討 論

眾所周知，實(shí)體腫瘤由于生長(zhǎng)迅速，組織中血管豐富，但其血管結(jié)構(gòu)特殊，使得大分子藥物能被動(dòng)的靶向于腫瘤組織，進(jìn)而減少其他組織的藥物分布，增加腫瘤組織的藥物濃度，從而降低藥物的體內(nèi)毒性，提高抗腫瘤效果。鹽酸伊立替康是一種臨床常用的較廣譜的小分子前體抗腫瘤藥物，其在體內(nèi)可代謝為抗腫瘤活性較強(qiáng)的SN-38繼而發(fā)揮作用，但SN-38毒性明顯強(qiáng)于伊立替康。靜脈滴注鹽酸伊立替康后，體內(nèi)藥物濃度達(dá)到最高，因此活性代謝產(chǎn)物SN-38的濃度也隨之增高，從而產(chǎn)生較嚴(yán)重的不良反應(yīng)。鹽酸伊立替康制備為納米膠束后，一方面可提高其腫瘤組織的靶向性，增強(qiáng)療效，同時(shí)減少其他組織臟器的分布，降低不良反應(yīng)；另一方面可達(dá)到緩釋的效果，穩(wěn)定釋放伊立替康，延長(zhǎng)療效，也降低了SN-38的瞬時(shí)藥物濃度，減輕毒性。本文比較了伊立替康市售制劑及其納米膠束制劑在荷瘤小鼠體內(nèi)的最大耐受劑量及抗腫瘤效果，結(jié)果顯示，荷瘤小鼠對(duì)納米膠束制劑的最大耐受劑量較市售制劑有較大程度的提高，提示納米制劑體內(nèi)毒性降低；同時(shí)，由于納米膠束制劑體內(nèi)毒性降低，體內(nèi)給藥劑量得以提高，從而實(shí)現(xiàn)了更好的抗腫瘤效果。這提示伊立替康納米膠束制劑值得更進(jìn)一步深入研究，以期改善伊立替康的臨床毒性，優(yōu)化臨床應(yīng)用方案。