紫薯醋釀造工藝優(yōu)化

范振宇，程浩華，樊迎，王如福*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 晉中 030801)

紫薯(Solanumtuberdsm)是一種旋花科草本植物，肉質(zhì)呈現(xiàn)紫色或深紫色。紫薯因含有花色苷、多糖、黃酮類、硒元素、綠原酸、異綠原酸等功能性成分，故有抗氧化、抗瘤、抗癌、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、降血糖、降血脂及保肝等生理保健功能[1-3]。目前，我國對紫薯產(chǎn)品的開發(fā)主要在飲料、全粉、糕點等傳統(tǒng)加工方面[4，5]，而對其深加工產(chǎn)品的研發(fā)還略顯薄弱。

食醋含有豐富的有機酸、維生素、礦物質(zhì)、堿土金屬元素、氨基酸等營養(yǎng)成分和川穹嗪等功能活性成分，賦予了食醋絕佳的調(diào)味作用和抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗癌、抗腫瘤、降膽固醇、抗高血壓等功能特性[6-9]。近年來，多種果蔬醋及其醋飲料制品異軍突起，在顏色和口感等方面均為陳醋市場注入了新鮮的血液。紫薯顏色獨特，碳水化合物含量較高，不失為釀醋的理想原料。

本文以紫薯為原料，經(jīng)酒化發(fā)酵、醋化發(fā)酵釀造形成紫薯醋，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對釀造工藝進行優(yōu)化，以對紫薯深加工和紫薯醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

紫薯：新鮮紫薯，市售(京薯6號)；耐高溫α-淀粉酶(食品級)：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；糖化酶(食品級)：湖南鴻鷹生物科技有限公司；乙醇(食品級)：鄭州億邦實業(yè)有限公司；釀酒酵母(Y63)、巴氏醋桿菌(A3-7)：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西老陳醋研究中心。

1.1.2 試驗設(shè)備

THZ-82水浴恒溫振蕩器 常州潤華電器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LS-35LJ立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZQPI-200立體式全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；WZ-108手持式折射測糖儀 北京萬成北增精密儀器有限公司；DS-1型組織搗碎機 上海昂尼儀器儀表有限公司；STARER3100 pH儀 奧豪斯儀器有限公司；DZTW電子調(diào)溫電熱套 天津工興試驗室儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點[10-13]

新鮮紫薯→清洗→去皮→切丁→蒸煮→打漿、調(diào)漿→液化→糖化→滅酶→紫薯液→調(diào)節(jié)糖濃度→酒化→醋化→澄清→過濾→滅菌→紫薯醋。

紫薯漿的制備：將新鮮紫薯清洗干凈、去皮后用刀切成紫薯丁，放置到蒸鍋內(nèi)蒸煮30 min后，按照1∶3的料液比加水打漿，得到紫薯漿。

紫薯漿的液化、糖化：將調(diào)好的紫薯漿放置在65 ℃恒溫水浴中，按照0.06 g/dL添加α-淀粉酶，恒溫水浴15 min，再按照0.1 g/dL加入糖化酶，恒溫水浴60 min，液化和糖化完成后，將紫薯漿放置于90～95 ℃條件下滅酶，30 min后取出，冷卻，備用。

菌種活化及擴培：將菌株Y63、A3-7活化、擴培后調(diào)整菌液濃度為106～107cfu/mL。

接種、發(fā)酵：將紫薯漿冷卻至約30 ℃時，接入酵母菌進行酒化發(fā)酵，酒化前3天有氧發(fā)酵，每天攪拌酒醪，3天后封口進行無氧發(fā)酵。酒化結(jié)束后，加入醋酸菌進行醋化發(fā)酵。

1.2.2 酒化發(fā)酵單因素試驗

選取pH(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)、發(fā)酵溫度(24，26，28，30，32 ℃)、酵母菌添加量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)進行單因素試驗，考察這3個因素對酒醪酒精度的影響。

1.2.3 酒化發(fā)酵響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以酒精度為評價指標(biāo)進行響應(yīng)面試驗，優(yōu)化酒化發(fā)酵的發(fā)酵條件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.4 醋化發(fā)酵單因素試驗

選取pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)、初始酒度(6%、7%、8%、9%、10%)、醋酸菌添加量(6%、7%、8%、9%、10%)進行單因素試驗，考察這3個因素對紫薯醋總酸的影響。

1.2.5 醋化發(fā)酵響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以總酸作為評價指標(biāo)進行響應(yīng)面試驗，優(yōu)化醋化發(fā)酵的發(fā)酵條件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.6 測定方法

pH 值的測定：將酸度計直接插入待測樣品中，做3次平行試驗，取平均值，即為該樣品的pH值。

酒化發(fā)酵結(jié)束后測定酒精度，酒精度采用蒸餾法進行測定[14]。

醋化發(fā)酵結(jié)束時測定總酸[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒化發(fā)酵單因素試驗

2.1.1 酒化發(fā)酵pH的確定

圖1 酒化階段發(fā)酵pH值對酒精度的影響Fig.1 Effect of pH values on alcohol degree in alcoholization stage

酵母菌一般在pH 3.0～7.5的條件下生長，因pH值的不同，使得酵母菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力、細胞中的酶促反應(yīng)速率和其本體的代謝能力發(fā)生改變，故而其生成酒精的能力也將改變。由圖1可知，當(dāng)pH值小于6.5時，伴隨著pH值的增加，發(fā)酵液中的酒精度也在不停地增加；當(dāng)pH值達到6.5時，酒精度達到了最大值6.7%；隨著pH值的持續(xù)增大，酒精度的變化趨勢逐漸減小。這是因為當(dāng)酵母菌過量增加時會消耗掉紫薯液中的營養(yǎng)成分用于自身的繁殖，因而用于轉(zhuǎn)化酒精的糖就會減少。由此可知，酵母菌在酒化階段發(fā)酵產(chǎn)酒的最佳pH值為6.5。

2.1.2 酒化發(fā)酵溫度的確定

由圖2可知，起初隨著溫度的升高，發(fā)酵液中酵母菌活力逐漸增大，酒精度會隨之升高；當(dāng)溫度處于28 ℃時，酒精度最高，為7.1%；當(dāng)溫度超過28 ℃時，酒精度隨著溫度的升高而降低。這是因為酵母菌生長代謝需要一個適合的溫度范圍，當(dāng)溫度過高時，雖然酵母菌生長較為迅速，發(fā)酵速度會越發(fā)增快，但與此同時衰老速度也會加快，對外表現(xiàn)為發(fā)酵液的最終酒精度下降，故發(fā)酵溫度選擇在28 ℃最為適宜。

圖2 酒化階段溫度對酒精度的影響Fig.2 Effect of temperatures on alcohol degree in alcoholization stage

2.1.3 酒化發(fā)酵酵母菌添加量的確定

圖3 酒化階段酵母菌添加量對酒精度的影響Fig.3 Effect of yeast additive amount on alcohol degree in alcoholization stage

當(dāng)酵母菌處于缺氧條件下時，會將糖分解為酒精和二氧化碳，在相同的條件下，酵母添加量越高，成長繁殖的酵母菌就會越多，酒精的生成速率也就越快。由圖3可知，當(dāng)酵母菌添加量小于0.2%時，隨著酵母菌添加量的增加，最終所產(chǎn)生的酒精度不斷增加；當(dāng)酵母菌添加量為0.2%時，所產(chǎn)生的酒精度最高，為6.3%；隨著酵母菌添加量的持續(xù)增加，大于峰值后，因其受到了底物濃度的限制，所產(chǎn)生的酒精度會逐步減少。綜合考慮，酵母菌添加量處于0.2%時最為合適。

2.2 酒化發(fā)酵響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，見表3。

表3 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果Table 3 Experimental scheme and results of response surface

續(xù) 表

使用軟件以pH、溫度和酵母菌添加量為響應(yīng)變量，同時以酒精度為指標(biāo)值(響應(yīng)值)，對表3的數(shù)據(jù)進行分析處理，得到表4回歸方程的方差分析表。利用該軟件進行二次多項式擬合(非線性)，可以得到以下預(yù)測模型：

Y=7.08+0.088A+0.44B+0.025C-0.30AB+0.28AC+0.025BC-0.26A2-0.67B2-0.44C2。

表4 回歸模型的顯著性檢驗和方差分析Table 4 Significance test and variance analysis of regression model

根據(jù)回歸方差分析顯著性檢驗，該模型為回歸顯著型，即P<0.0001，且失擬項不顯著，為0.2531。說明該模型與實際試驗有很好的擬合性，自變量與指標(biāo)值之間的線性關(guān)系顯著，可以用于紫薯醋酒化工藝實驗的預(yù)測。

2.2.2 各因素及其交互作用對酒精度的影響

基于回歸模型方差分析，用軟件做出的pH(A)、溫度(B)和酵母菌添加量(C)對酒精度影響的等高線及三維圖見圖4。等高線的形狀呈圓形或者橢圓形反映交互效應(yīng)的強弱程度，若為圓形，則交互作用不顯著；若為橢圓形，則交互作用顯著。

圖4 各因素交互作用對酒精度影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 The response surface and contour lines of the influence of the interaction of various factors on alcohol degree

利用Design Expert軟件對二次回歸模型進行分析，繪制響應(yīng)面分析圖，圖4等高線和響應(yīng)面圖中，每個立體圖代表AB、AC、BC兩個獨立變量之間的交互作用。由圖4可知，AB(pH和溫度)、AC(pH和酵母菌添加量)的交互作用均顯著，BC(溫度和酵母菌添加量)的交互作用不顯著。

由響應(yīng)面軟件分析所得到的酒化發(fā)酵的最優(yōu)條件為：pH 6，溫度28.66 ℃，酵母菌添加量0.2%。在此條件下得到預(yù)測酒精度為7.15259%。

根據(jù)實際實驗情況，將以上最優(yōu)條件調(diào)整為：pH 6，溫度29 ℃，酵母菌添加量0.2%。在此條件下進行實驗測出的酒精度為7.1%。此結(jié)果與理論預(yù)測值很接近。因此，利用該響應(yīng)面法所得到的優(yōu)化條件準(zhǔn)確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

2.3 醋化發(fā)酵單因素試驗

2.3.1 醋化發(fā)酵中pH 的確定

圖5 醋化階段pH對酸度的影響Fig.5 Effect of pH values on acidity in acetification stage

由圖5可知，在pH值<5時，隨著初始pH的升高，醋酸菌的產(chǎn)酸量也逐漸上升；當(dāng)pH值達到5時，醋酸菌處于最高效的環(huán)境，總酸達到峰值4.9 g/dL；在pH超過5逐漸增大后，總酸呈下降狀態(tài)，故pH 5為醋酸菌的最適pH。

2.3.2 醋化發(fā)酵初始酒度的確定

圖6 醋化階段初始酒度對酸度的影響Fig.6 Effect of initial alcohol content on acidity in acetification stage

由圖6可知，初始酒精度在7%～9%范圍時，醋酸菌的產(chǎn)酸量處在較高水平。在一定的初始酒精度范圍內(nèi)(酒精度小于8%)，隨著酒精度升高，其總酸會相應(yīng)增加。酒精度過高或過低對醋化的影響都十分顯著。當(dāng)酒精度為8%時，總酸量最大，達到了5.3 g/dL。當(dāng)酒精度大于8%后，醋酸菌產(chǎn)酸量急劇下降，這是由于醋酸菌的生長需要足夠的能量來維持，而乙醇為醋酸菌提供碳源的主要物質(zhì)，如果酒精度過低，不能夠滿足醋酸菌對碳源的需要，從而抑制了醋酸菌的繁殖和生長，導(dǎo)致產(chǎn)酸量減少；當(dāng)酒精度過高時，對醋酸菌也會有抑制作用，降低產(chǎn)酸量。綜合來看，選擇初始酒精度8%最為合適。

2.3.3 醋化發(fā)酵醋酸菌接種量的確定

圖7 醋化階段醋酸菌接種量對酸度的影響Fig.7 Effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on acidity in acetification stage

由圖7可知，醋酸菌接種量小于8%時，醋酸菌的產(chǎn)酸量會隨著醋酸菌接種量的增加而增加；當(dāng)醋酸菌接種量等于8%時，總酸達到最大值5.6 g/dL；醋酸菌接種量大于8%時，產(chǎn)酸量也會逐漸減少。醋酸菌接種量過高或者過低都不利于醋化發(fā)酵，如果接種量過低，就沒有足夠的醋酸菌產(chǎn)酸；如果接種量過高，又會導(dǎo)致醋酸菌利用乙醇生長繁殖產(chǎn)生水和二氧化碳，不但副產(chǎn)物會增加，也會導(dǎo)致醋酸菌相繼老化，降低產(chǎn)酸效率。綜合來看，醋酸菌的接種量在8%時最合適。

2.4 醋化發(fā)酵響應(yīng)面試驗

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，見表5。

表5 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果Table 5 Experimental scheme and results of response surface

續(xù) 表

使用軟件以pH、初始酒精度和醋酸菌接種量為響應(yīng)變量，同時以總酸為指標(biāo)值(響應(yīng)值)，對表5的數(shù)據(jù)進行分析處理，得到表6回歸方程的方差分析表。利用該軟件進行二次多項式擬合(非線性)，可以得到以下預(yù)測模型：

Y=5.58+0.081A+0.25B+0.20C+0.037AB+0.13AC+0.013BC-0.22A2-0.50B2-0.33C2。

表6 回歸模型的顯著性檢驗和方差分析Table 6 Significance test and variance analysis of regression model

根據(jù)回歸方差分析顯著性檢驗，該模型為回歸顯著型，即P<0.0001，且失擬項不顯著，為0.3082。說明該模型與實際試驗有很好的擬合性，自變量與指標(biāo)值之間的線性關(guān)系顯著，可以用于紫薯醋醋化工藝實驗的預(yù)測。

2.4.2 各因素及其交互作用對總酸的影響

基于回歸模型方差分析，用軟件做出的pH(A)、初始酒精度(B)和醋酸菌接種量(C)對總酸影響的等高線及三維圖見圖8。等高線的形狀呈圓形或者橢圓形反映交互效應(yīng)的強弱程度，若為圓形，則交互作用不顯著；若為橢圓形，則交互作用顯著。

圖8 各因素交互作用對酒精度影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 The response surface and contour lines of the influence of the interaction of various factors on acidity

利用Design Expert軟件對二次回歸模型進行分析，繪制響應(yīng)面分析圖，由圖8可知，每個立體圖代表AB、AC、BC兩個獨立變量之間的交互作用，AB(pH和初始酒精度)、AC(pH和醋酸菌接種量)的交互作用顯著，BC(初始酒精度和醋酸菌接種量)的交互作用不顯著。

由響應(yīng)面軟件分析所得到的醋化發(fā)酵的最優(yōu)條件為：pH 5.16，初始酒精度8.27%，醋酸菌接種量8.37%。在此條件下得到預(yù)測總酸為5.566415 g/dL。

根據(jù)實際實驗情況，將以上最優(yōu)條件調(diào)整為：pH 5，初始酒精度8%，醋酸菌接種量8%。在此條件下進行實驗測得總酸為5.5 g/dL，此結(jié)果與理論預(yù)測值很接近。因此，利用該響應(yīng)面法所得到的優(yōu)化條件準(zhǔn)確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗對紫薯醋的酒化發(fā)酵、醋化發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得到酒化發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵工藝：pH為6，溫度為29 ℃，酵母菌添加量為0.2%，在該發(fā)酵工藝條件下測得酒化階段結(jié)束后紫薯酒的酒精度為7.1%。醋化發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵工藝：pH為5，初始酒度為8%，醋酸菌接種量為8%，在該發(fā)酵工藝條件下測得醋化階段結(jié)束后紫薯醋的酸度為5.5 g/dL。本研究結(jié)果可為紫薯醋釀造工藝提供理論參考依據(jù)，促進紫薯資源的綜合開發(fā)利用。