豬圓環(huán)病毒3型PCR檢測(cè)方法的建立及其分子流行病學(xué)調(diào)查

楊 斌，黃紅亮，吳玉全，廖翠銀，方倪冉，王志偉，陳瑞愛(ài),

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642 ； 2.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東新興527400)

豬圓環(huán)病毒(PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是一種無(wú)囊膜、共價(jià)閉合的單股環(huán)狀DNA病毒，也是目前已知最小的動(dòng)物DNA病毒。豬圓環(huán)病毒目前主要由PCV1、PCV2和PCV3組成。PCV2主要包含2個(gè)開(kāi)放性閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼復(fù)制酶(Rep)和衣殼蛋白(Cap)，ORF1是最大的ORF，編碼296aa的Rep蛋白，ORF2編碼的Cap蛋白是PCV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白和主要抗原[1-3]，臨床上主要表現(xiàn)為感染的仔豬消瘦、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸系統(tǒng)疾病和母豬繁殖障礙等[4-5]。2015年P(guān)CV3在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在北美，亞洲，歐洲等3個(gè)大洲多個(gè)國(guó)家被檢出患病豬只的組織中含有PCV3[6]。目前，PCV3已經(jīng)成為造成養(yǎng)豬業(yè)損失的重要病因之一，并且還有加劇的趨勢(shì)。可見(jiàn)，及時(shí)掌握我國(guó)PCV3的流行狀況及建立快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法迫在眉睫，本實(shí)驗(yàn)室建立了一種簡(jiǎn)單、特異、靈敏的PCR檢測(cè)方法，同時(shí)利用該方法對(duì)我國(guó)14個(gè)省市的病豬樣品進(jìn)行檢測(cè)并測(cè)序，通過(guò)同源性分析，為預(yù)防和控制PCV3的流行傳播奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品 樣品主要采集自河南、陜西、江西、廣西、四川、重慶等14個(gè)省(市)的90多個(gè)大型豬場(chǎng)的322份疑似感染病料。

1.1.2 毒株 豬瘟病毒毒株(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒毒株(PCV2)、豬偽狂犬病病毒株(PRV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 DNA抽提試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司，TAE 緩沖液(Tris-acetate-EDTA)購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)有限公司，PCR試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖?、膠回收試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)豬圓環(huán)病毒3型分離株 PCV3-Hebei-LY_2015(GenBank 登錄號(hào)：MF318451.1)設(shè)計(jì)了特異性鑒定引物及Cap蛋白基因序列引物，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，引物序列如表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段大小

1.2.2 病料DNA抽提 將疑似陽(yáng)性病料進(jìn)行剪碎、研磨，加入2倍體積生理鹽水配成1∶2的懸液，放入-70 ℃超低溫冰箱反復(fù)凍融3次后，8 000 r/min離心5 min，收集200 μL樣品，參照DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 將抽提物用鑒定引物PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并回收，回收產(chǎn)物連接pMD-18T載體后，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，經(jīng)過(guò)搖菌挑菌、抽提質(zhì)粒，送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。檢測(cè)其濃度作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.2.4 PCR方法的建立 通過(guò)改變單一要素分別對(duì)模板量(1～2.5 μL)、PCR循環(huán)次數(shù)(25～40)、退火溫度(52.5 ℃～59.6 ℃)等條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的PCR反應(yīng)條件。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 分別選取豬圓環(huán)病毒3型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒的病毒液提取基因組后用以上鑒定引物及優(yōu)化后的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，檢測(cè)其特異性。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)品PMD-PCV3進(jìn)行10-1～10-9稀釋?zhuān)脙?yōu)化后的條件分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，檢測(cè)敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 采用優(yōu)化后的PCR方法對(duì)來(lái)自全國(guó)的3份陽(yáng)性病料提取的DNA分別重復(fù)3次擴(kuò)增，共擴(kuò)增9次，重復(fù)多孔同步檢測(cè)驗(yàn)證其重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)來(lái)自云南、四川、重慶等14個(gè)省(市)90多家豬場(chǎng)的322份樣品進(jìn)行檢測(cè)，樣品包括流產(chǎn)胎兒和仔豬的心臟、肝臟、肺臟、腎臟等組織。

1.2.9 PCV3 Cap蛋白基因檢測(cè) 應(yīng)用1.2.1設(shè)計(jì)的引物對(duì)部分省份的PCV3陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增 Cap蛋白基因并測(cè)序，采用DNAMAN軟件和MEGA6軟件與GenBank登陸的PCV3 Cap蛋白基因序列進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 將鑒定引物經(jīng)PCR獲得的約330 bp目的條帶回收，連接pMD-18T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，平板培養(yǎng)后經(jīng)PCR挑取陽(yáng)性菌株，測(cè)序后與GenBank登陸的PCV3序列比對(duì)，同源性為99%～100%，表明該序列確實(shí)為PCV3序列。取陽(yáng)性菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒后，檢測(cè)其濃度為252 ng/μL，經(jīng)計(jì)算拷貝數(shù)為8.3×109/μL。將質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品放-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR方法的優(yōu)化和建立 通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，得到PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系為：rTaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2.5 μL，加ddH2O至總體系20 μL。PCR最佳反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56.7 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。如圖1所示，成功擴(kuò)增到約330 bp的PCV3目的條帶。

2.3 特異性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)病毒液均未擴(kuò)增到條帶(圖2)，PCV3陽(yáng)性樣品擴(kuò)增到約330 bp的條帶，表明建立的PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

圖1 PCV3 核酸PCR擴(kuò)增

M：Marker； 1～2：PCV3目的條帶

圖2 特異性試驗(yàn)

M：DL-2 000 ； 1：PCV3 ； 2：CFSV ； 3： PRRSV ； 4： PCV2 ； 5： PRV

2.4 敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)品PMD-PCV3作10倍系列稀釋?zhuān)瑥?0-1稀釋至10-9，用建立的PCR方法分別進(jìn)行擴(kuò)增、電泳，檢測(cè)引物的敏感性。結(jié)果顯示，當(dāng)樣品稀釋至10-8時(shí)，用該方法檢測(cè)為陽(yáng)性(圖3)，通過(guò)換算其檢測(cè)下限為830拷貝/μL，表明該方法具有良好的敏感性。

圖3 敏感性試驗(yàn)

M： DL-2 000 ； 1～9泳道：模板濃度分別為10-1～10-9

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的PCR方法對(duì)來(lái)自全國(guó)的3份陽(yáng)性病料提取的DNA擴(kuò)增，每份重復(fù)3次共擴(kuò)增9次，結(jié)果均為陽(yáng)性，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 臨床樣品檢測(cè) 從2017年10月份至2018年7月份，對(duì)來(lái)自云南、四川、重慶等14個(gè)省(市)的94家豬場(chǎng)的332份樣品進(jìn)行檢測(cè)，樣品包括流產(chǎn)胎兒和仔豬的心臟、肝臟、肺臟、腎臟等，檢測(cè)結(jié)果顯示：在8個(gè)省(市)的樣品中檢測(cè)到PCV3(表2)， 豬場(chǎng)陽(yáng)性率為36.5%，個(gè)體陽(yáng)性率在23.2%，其中養(yǎng)豬大省，四川、廣東、河南等檢出率均高于27%，從PCV3的流行分布情況來(lái)看，主要集中在我國(guó)中西部、中東部以及華南地區(qū)。

表2 樣品檢測(cè)信息

2.7 PCV3的Cap蛋白基因分析 隨機(jī)挑取6個(gè)省(市)的樣品進(jìn)行Cap蛋白基因擴(kuò)增并測(cè)序。經(jīng)同源性分析，6份Cap蛋白基因序列之間的同源性為98.6%～100%，與國(guó)內(nèi)序列同源性為97.3%～99.3%，與泰國(guó)序列為97.6%～98.3%，與韓國(guó)序列為97.5%～99.3%，與巴西序列為97.6%～99.2%，與意大利序列為98.6%～99.3%，與美國(guó)序列為97.3%～98.1%，與瑞典序列為97.8%～98.5%(圖4)；經(jīng)分子進(jìn)化分析，2018年檢測(cè)到的6個(gè)PCV3 Cap蛋白基因序列與2016-2017年間檢測(cè)到的并不在同一進(jìn)化分支，而是獨(dú)立處于另一小分支上(圖5)。

3 討論

2015年美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)Palinski等研究人員從北卡羅來(lái)納州的一個(gè)暴發(fā)PDNS(皮炎和腎病綜合征)的豬場(chǎng)中分離到了一種新型豬圓環(huán)病毒，并且通過(guò)宏觀基因組測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析將其命名為豬圓環(huán)病毒3型(PCV-3)[2]。隨后在西班牙、泰國(guó)、韓國(guó)等地相繼報(bào)道在患病豬只中發(fā)現(xiàn)PCV3[6]。2017華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何啟蓋教授對(duì)我國(guó)PCV3臨床調(diào)查，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)8個(gè)省和1個(gè)直轄市存在PCV3陽(yáng)性豬只[1-3]，同時(shí)劉曉旭等人對(duì)我國(guó)安徽、山東等10個(gè)省份的66個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)部分省(區(qū))陽(yáng)性率較高[7]。因此如何及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)PCV3，成為預(yù)防和控制PCV3的關(guān)鍵。PCR技術(shù)具有靈敏、簡(jiǎn)單、特異、快速且易于操作等特點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用[8]。

圖4 PCV3 Cap蛋白基因同源性分析

圖5 PCV3 Cap 遺傳進(jìn)化樹(shù)

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室所建立的PCV3檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自河南、陜西、江西、廣西、四川、重慶等14個(gè)省及直轄市332例疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為36.5%，個(gè)體陽(yáng)性率為23.2%。由此可見(jiàn)，PCV3已經(jīng)成為流行趨勢(shì)，并具有蔓延的態(tài)勢(shì)。本研究并未對(duì)東北三省的PCV3流行情況進(jìn)行調(diào)查，但是根據(jù)目前報(bào)道來(lái)看，東北三省PCV3陽(yáng)性率并不高，由此可以看出PCV3流行傳播具有區(qū)域性。

本研究隨機(jī)挑取6個(gè)省(市)的樣品進(jìn)行Cap蛋白基因擴(kuò)增并測(cè)序，與2016-2017年間世界各地在GenBank登陸的序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，6份Cap蛋白基因序列之間的同源性為98.6%～100%，與國(guó)內(nèi)序列同源性為97.3%～99.3%，與泰國(guó)序列為97.6%～98.3%，與韓國(guó)序列為97.5%～99.3%，與巴西序列為97.6%～99.2%，與意大利序列為98.6%～99.3%，與美國(guó)序列為97.3%～98.1%，與瑞典序列為97.8%～98.5%，表明不同地域之間的PCV3 Cap基因序列已存在一定的差異，從遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，2018年所檢測(cè)到的6個(gè)PCV3 Cap蛋白基因與2016-2017年檢測(cè)到的并不在同一進(jìn)化分支，由此推測(cè)PCV3隨著時(shí)間推移，存在部分的基因突變。通過(guò)本次試驗(yàn)，可以為進(jìn)一步預(yù)防和控制PCV3的傳播蔓延打下理論基礎(chǔ)。