京尼平對小鼠棕色和白色脂肪組織UCP1表達的影響*

申娜娜， 宮德正， 鄒豐鍇， 嚴(yán) 宇， 關(guān)莉莉， 鄒 原

(大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 遼寧 大連 116044)

肥胖呈逐年上升趨勢，與肥胖密切相關(guān)的代謝性疾病如2型糖尿病、高血壓、心腦血管病、腫瘤等成為全球性公共健康問題，預(yù)防和治療肥胖具有重要的意義[1]。已知脂肪組織可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織。白色脂肪組織主要功能是將能量以三酰甘油的形式儲存于大脂滴中，同時分泌各種不同的內(nèi)分泌激素(如瘦素，脂聯(lián)素等)來調(diào)節(jié)人體能量平衡[2-3]，白色脂肪組織中的脂肪細(xì)胞在某些因素作用下，可表達產(chǎn)熱基因，增加能量消耗。這過程稱為“白色脂肪組織棕色化”。棕色脂肪組織主要功能是通過解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)介導(dǎo)的解偶聯(lián)作用，減少腺苷三磷酸(ATP)正常產(chǎn)生，將能量以熱能的形式散發(fā)，參與非震顫性產(chǎn)熱和供能，不僅維持體溫平衡，還增加能量消耗，利于抵抗肥胖的形成等，因此促進棕色脂肪組織活化及白色脂肪組織棕化是改善肥胖的新策略[4]。

京尼平是中藥梔子的主要成分梔子苷的水解產(chǎn)物。較多研究顯示京尼平有抗炎、抗氧化，治療糖尿病、癌癥以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等作用[5-9]。我們前期研究證明京尼平可改善老齡大鼠胰島素抵抗，降低食源性肥胖大鼠攝食量和體重的作用[7]，但其對脂肪組織活化和棕化是否有作用，目前尚不清楚。因此，本研究觀察京尼平對棕色脂肪組織活化和白色脂肪組織棕化的作用，以進一步了解京尼平降脂減肥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

京尼平購自Wako公司/日本；TRIzol試劑購自天根生化科技有限公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技有限公司；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green)購自天根生化科技有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液購自碧云天生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生化科技有限公司；Anti-UCP1抗體購自Abacam公司；Anti-β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組與處理

實驗選用雄性8周齡C57BL/6J小鼠(購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。實驗遵循大連醫(yī)科大學(xué)動物倫理規(guī)范要求。正常飲食、飲水，小鼠飼養(yǎng)在室溫為22℃±2℃，濕度控制于55%～65%，晝夜時間均為12 h，適應(yīng)一周之后，隨機分為正常對照組、京尼平組和冷刺激組，每組10只。京尼平組小鼠給予腹腔注射京尼平處理(15 mg/(kg·d)，連續(xù)9 d)，對照組給予生理鹽水處理，冷刺激組小鼠室溫下處理4 d后，置于4℃寒冷環(huán)境中持續(xù)5 d(24 h/d)冷刺激處理。實驗期間，每天監(jiān)測各組小鼠的體溫、攝食量和體重變化，在實驗的第10日，采集各組小鼠皮下(腹股溝區(qū))、內(nèi)臟(附睪及腎周)的白色脂肪組織及肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織，稱量各脂肪組織的濕重，計算體脂率(脂肪質(zhì)量/體重)，之后將組織經(jīng)液氮速凍后儲存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ〖珉蜗聟^(qū)、腹股溝區(qū)及附睪周圍的部分脂肪組織觀察形態(tài)學(xué)的變化，測定棕色脂肪組織、皮下白色脂肪組織以及內(nèi)臟白色脂肪組織解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)的表達。

1.3 脂肪組織形態(tài)觀察

制片：將肩胛下區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪周圍的部分脂肪組織置于10%的福爾馬林液中，用梯度酒精脫水、浸蠟包埋，并通過切片機將其切成5～6 μm的薄片，烘干備用。HE染色：切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇(無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇)脫去二甲苯，加入蘇木精染色，經(jīng)1%鹽酸酒精分化，此時細(xì)胞核及核糖體成藍(lán)紫色。再加入伊紅染料，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淡紅色或者紅色。二甲苯透明，蓋片封片。

1.4 實時定量PCR分析

總RNA用TRIzol法提取獲得；cDNA是用2 μg總RNA通過FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)方法制備；QPCR用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒進行檢測。UCP1的引物序列：Forward：5’-AGGCTTCCAGTACCATTAGGT-3’，Reverse： 5’-CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT-3’；β-actin的引物序列：Forward：5’-CCTAAGGCCAACCGTGAAAA-3’，Reverse：5’-CAGAGGCATACAGGGACAGCAC-3’。反應(yīng)條件是95℃ 15 min×1, (95℃ 10 s、55℃ 30 s、72℃ 32 s)×40。熒光定量PCR結(jié)果均使用Agilent MX3005 Real Time PCR(美國)擴增儀檢測得出。檢測結(jié)果用2-△△CT法進行分析。

1.5 Western blot

組織剪碎后放入添加了PMSF的Western及IP細(xì)胞裂解液中充分裂解，取上清獲得總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳(BIO-RAD)，之后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用TBST配置5%的脫脂奶粉常溫下封閉1 h，清洗膜后在4℃條件下孵育一抗過夜。常溫下孵育二抗1 h。凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD)檢測膜上目的條帶發(fā)光亮度。ImageJ軟件系統(tǒng)進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 京尼平對小鼠體重、攝食量和體溫的影響

京尼平組小鼠的體重、攝食量與對照組相比無差異，但體溫在實驗的第8日后與對照組相比有差異(P<0.05，圖1A、B、C)。冷刺激組小鼠進行冷刺激處理后第3日，體重下降，小于常溫條件下的小鼠(圖1A)；攝食量大于常溫下的兩組小鼠，在實驗第7日和第8日(冷刺激后第3日和第4日)時增加明顯(P<0.01，圖1B)。冷刺激處理可使小鼠體溫顯著下降(P<0.01, 圖1C)。

Fig.1Effects of genipin on body weight, food intake and body temperature of mice(n=10)

A: Body weight; B: Food intake; C: Body temperature. In the first four days, three groups of mice were in the normal temperature environment, and in the later five days, the mice with cold-stimulus were exposed to 4℃ environment

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2 京尼平對脂肪組織濕重、體脂率的影響

與對照組相比，京尼平組棕色脂肪組織的濕重明顯增加(P<0.05，表1)；冷刺激組棕色脂肪組織濕重也有增加，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，表1)。與對照組相比，京尼平組和冷刺激組白色脂肪組織的濕重明顯減少(P<0.05，表1)，體脂率亦明顯減少(P<0.05，表1)。

GroupWet weight of brown adipose(g)Wet weight of white adipose(g)Body fat rate(%)Control0.045±0.0080.331±0.0441.633±0.159Genipin0.066±0.003*0.277±0.033*1.200±0.113*Cold-stimulus0.058±0.0080.219±0.194*1.133±0.095*

*P<0.05vscontrol group

2.3 京尼平對脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

與對照組相比，京尼平組和冷刺激組的棕色脂肪細(xì)胞脂滴變小，數(shù)量增加(圖2A1-A3)。京尼平組的皮下和內(nèi)臟白色脂肪細(xì)胞均出現(xiàn)與冷刺激組相似的變化，與對照組脂肪細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)脂滴變小，數(shù)量增加(圖2B1-B3，C1-C3)。

Fig.2Morphological analysis of adipose tissues after genipin treatment(HE staining ×200)

A1, A2 and A3 represent brown adipocytes of control group, genipin group and cold-stimulus group respectively; B1, B2and B3represent subcutaneous adipocytes of control group, genipin group and cold-stimulus group respectively; C1, C2and C3represent visceral adipocytes of control group, genipin group and cold-stimulus group respectively

2.4 京尼平對脂肪組織的UCP1 mRNA表達的影響

棕色脂肪組織中UCP1 mRNA水平在冷刺激組的表達量相對于對照組顯著增加(P<0.01，表2)；京尼平組的UCP1 mRNA水平的表達量與對照組相比也有顯著增加(P<0.05, 表2)。皮下脂肪組織中，京尼平組和冷刺激組小鼠UCP1 mRNA水平均顯著升高，與對照組相比差異顯著(P<0.05，表2)。內(nèi)臟脂肪組織中，京尼平組和冷刺激組的UCP1 mRNA水平相對于對照組均明顯增加(P<0.05，表2)。

Group2-△△CT (BAT)2-△△CT(SAT)2-△△CT(VAT)Control1.000±0.1841.000±0.0201.000±0.076Genipin2.881±0.455*24.460±7.735*2.041±0.408*Cold-stimulus17.700±1.042**11.720±2.757*3.228±0.225*

BAT: Brown adipose tissue; SAT: Subcutaneous adipose tissue; VAT: Visceral adipose tissue

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.5 京尼平對脂肪組織的UCP1蛋白表達的影響

進一步觀察京尼平對脂肪組織UCP1蛋白表達的作用。結(jié)果顯示，棕色脂肪組織中，京尼平組和冷刺激組UCP1蛋白表達量，相對于對照組均明顯增加(P<0.05, 圖3A)。皮下白色脂肪組織、內(nèi)臟白色脂肪組織中，京尼平和冷刺激處理后，UCP1蛋白表達量與對照組相比均明顯增加(P<0.05和P< 0.01, 圖3B，3C)。

Fig.3Genipin upregulates UCP1 protein expression in adipose tissues(n=3)

A: Brown adipose tissue; B: Subcutaneous adipose tissue; C: Visceral adipose tissue

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 討論

有研究顯示，在寒冷刺激或者是β3腎上腺素受體激動劑的作用下，棕色脂肪細(xì)胞可以被活化，促進脂質(zhì)氧化分解，從而產(chǎn)熱增加，起到維持體溫的作用，且伴有體重減少的現(xiàn)象[10-12]。在腎上腺素受體激動劑或寒冷刺激下，白色脂肪組織中有部分白色脂肪細(xì)胞可發(fā)生類似棕色脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化，脂滴增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量增加，且棕色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因UCP1 mRNA表達增加，功能上也有類似棕色脂肪細(xì)胞耗能、產(chǎn)熱的作用，這些現(xiàn)象表明白色脂肪細(xì)胞發(fā)生了棕化[13-14]。有文獻證實，冷刺激處理的前3 d，體溫變化較為明顯，以后趨于平穩(wěn)[15]。因此，本實驗選用寒冷刺激作為陽性對照，并選用5 d作為冷刺激組小鼠冷暴露時長，以保證寒冷刺激后小鼠機體代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)，觀察京尼平是否具有與寒冷刺激相類似的促進脂肪組織“活化”或“棕化”作用。

本實驗結(jié)果顯示，京尼平處理后小鼠的體溫較對照組升高，棕色脂肪組織濕重增加，白色脂肪組織濕重以及體脂率下降，京尼平組和冷刺激組小鼠的3種脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴變小、數(shù)量增加等相同的形態(tài)變化。這些結(jié)果提示京尼平可促進棕色脂肪組織的活化和白色脂肪組織的棕化，增加脂肪的氧化分解，增加熱量的產(chǎn)生與釋放，減少小鼠體內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。有研究顯示，黃連素等可促進外周脂肪分解代謝，引起脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴變小、數(shù)量增加等形態(tài)變化[16-17]。我們的研究顯示京尼平也具有相似的作用。

另外，實驗中也觀察到，京尼平組和冷刺激組小鼠與對照組相比，棕色脂肪組織的顏色加深，白色脂肪組織的顏色也由白色變?yōu)闇\紅色。脂肪組織的顏色變化與已有的研究結(jié)果一致[15]。同時也有研究表明在高脂飲食的小鼠中，白色脂肪組織中特異性的血管內(nèi)皮生長因子表達增加，誘發(fā)白色脂肪組織棕化，增加棕色脂肪組織，從而達到預(yù)防肥胖和胰島素抵抗的作用，以往的研究可以解釋本實驗結(jié)果中脂肪組織顏色變化的現(xiàn)象[18-20]。

為進一步證實京尼平促進棕化的作用，我們分別從核酸和蛋白水平檢測棕色脂肪組織“活化”和白色脂肪組織“棕化”的標(biāo)志分子UCP1的表達。實驗結(jié)果顯示，京尼平組與冷刺激組小鼠UCP1在棕色脂肪組織、皮下白色脂肪組織和內(nèi)臟白色脂肪組織中的表達均上調(diào)。結(jié)果表明京尼平具有類似冷刺激促進棕色脂肪組織活化以及白色脂肪組織棕化的作用。因為京尼平和冷刺激是兩種不同屬性的刺激因素，因此，難以簡單比較二者對脂肪組織的作用效應(yīng)。目前已知冷刺激主要通過交感神經(jīng)和甲狀腺激素，促進脂肪組織的活化與棕化，而京尼平如何促進脂肪組織的活化與棕化，還需要進一步深入研究。此外，我們還觀察到，京尼平刺激皮下白色脂肪組織的UCP1 mRNA表達作用較棕色脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織更加明顯(表2)，這一現(xiàn)象與以往的研究結(jié)果相一致[15-21]。但是，皮下白色脂肪組織中UCP1蛋白表達結(jié)果顯示京尼平組沒有冷刺激組明顯(圖3)。這種核酸和蛋白水平上的表達差異可能由于是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用，具體的機制還需要進一步研究。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果證實京尼平可促進UCP1的表達，促進棕色脂肪組織的代謝活性和白色脂肪組織棕化，減少體內(nèi)脂肪的蓄積，從而達到降脂減肥的目的。該結(jié)果為京尼平在肥胖等代謝性疾病的防治應(yīng)用提供實驗依據(jù)。