復(fù)方扁咽寧對(duì)急性咽炎大鼠療效及其機(jī)制*

文德鑒， 袁麗君， 李三宇， 張翠蘭， 朱敏英， 胡澤華， 涂 星△

(1. 風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 恩施 445000； 2. 湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 恩施 445000)

急性咽炎是一種以咽部疼痛或干燥、有灼熱感或異物感，并在吞咽時(shí)加重為主要臨床表現(xiàn)的一類(lèi)常見(jiàn)疾病，復(fù)發(fā)率高，其發(fā)病機(jī)制主要是病毒、細(xì)菌或理化因素刺激造成的咽喉部炎癥反應(yīng)[1,2]。該病屬于中醫(yī)“急喉痹”證范疇，本質(zhì)上是本虛標(biāo)實(shí)，為風(fēng)熱循經(jīng)犯肺而蘊(yùn)熱，上侵咽喉致氣滯血壅，咽喉部出現(xiàn)黏膜紅腫而發(fā)病，治療上宜滋腎潤(rùn)肺、瀉火解毒[3-5]。復(fù)方扁咽寧方主要由連翹、玄參、麥冬、金銀花、野菊花、重樓等10味藥組成，主要配伍，以清熱解毒為主，兼具滋陰潤(rùn)肺、消腫止痛之功，為臨床使用多年治療急慢性咽炎、急慢性扁桃體炎發(fā)作期及緩解期的民間驗(yàn)方，其方藥組成簡(jiǎn)單，療效確切，復(fù)發(fā)率低，且未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)；但其作用機(jī)制尚不明確，對(duì)患者病灶部位的影響因取材的倫理問(wèn)題而無(wú)法開(kāi)展研究。

本研究擬通過(guò)氨水噴咽部誘導(dǎo)法建立急性咽炎大鼠模型，觀察復(fù)方扁咽寧治療急性咽炎模型大鼠的療效，考察其對(duì)損傷支氣管和肺組織的形態(tài)及血清IL-1β和TNF-α的含量影響，初步探討其治療急性咽炎的療效和抗炎作用機(jī)制，為該藥的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為該藥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠80只，體重(200±20)g，分籠飼養(yǎng)，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物與試劑

復(fù)方扁咽寧由玄參、桔梗、麥冬、重樓、赤芍等藥物組成，藥材均購(gòu)自湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院藥房；大鼠IL-1β ELISA試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DL-1電子萬(wàn)用爐，北京市永光明醫(yī)療器械有限公司；5810R低溫冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；KL型自動(dòng)脫水機(jī)、生物組織自動(dòng)包埋機(jī)、組織切片機(jī)等均購(gòu)于湖北康龍電子科技有限責(zé)任公司；JFC-1600離子濺射鍍膜儀、JSM-5610掃描電鏡，均購(gòu)于日本JEOL公司；Plus384型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)于美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.4 復(fù)方扁咽寧制備

按照復(fù)方扁咽寧的處方稱(chēng)取各味中藥，浸泡 0.5 h后，依次加8倍煎煮1.5 h，濾過(guò)，濾渣再加入6倍水，煎煮1 h后濾過(guò)，合并兩次濾液后，減壓濃縮至相當(dāng)于生藥0.576 g/ml、1.152 g/ml、2.304 g/ml，置于5℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動(dòng)物模型制備、分組及干預(yù)

根據(jù)文獻(xiàn)資料[5]選取SD雄性大鼠70只，體重(200±20)g，配制濃度為15%的氨水以自制噴霧器噴灑大鼠咽部(每次殘留咽部量約5～8 μl)，每次噴3下，每天兩次，連續(xù)3 d后，若大鼠出現(xiàn)撓抓口部以及咽部出現(xiàn)充血、腫脹即為造模成功。選取造模成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組，復(fù)方扁咽寧高、中、低劑量組，每組10只。另取SD大鼠10只，同法噴予等量蒸餾水，作為正常對(duì)照組。造模成功后第2日，復(fù)方扁咽寧高、中、低劑量組按12.5 ml/kg分別給以濃度為2.304 g/ml 、1.152 g/ml、0.576 g/ml的藥液對(duì)大鼠灌胃，即給藥劑量分別為28.8 g/kg, 14.4 g/kg, 7.2 g/kg(相當(dāng)于生藥)，正常對(duì)照組與模型組同法灌胃等量蒸餾水，每日一次，連續(xù)7 d。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 一般癥狀觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察和記錄各組動(dòng)物飲食、飲水變化、活動(dòng)狀態(tài)及大鼠咽部變化情況，包括黏膜形態(tài)和色澤、口腔分泌物。

1.6.2 血清中TNF-α以及IL-1β含量檢測(cè) 末次給藥24 h后，用10%的水合氯醛以3 ml/kg劑量麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈取血，置于抗凝離心管中混勻， 3 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照上海酶聯(lián)生物科技有限公司ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α以及IL-1β含量。

1.6.3 氣管及肺組織病理樣本的制備及觀察 處死動(dòng)物立即從環(huán)狀軟骨水平剪斷氣管食管，摘取氣管及左肺下葉組織，在10%甲醛溶液中固定，置于4℃冰箱中保存過(guò)夜。次日取材后經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.4 氣管纖毛樣本的制備及超微結(jié)構(gòu)觀察 在4℃操作臺(tái)上取長(zhǎng)2 cm氣管生理鹽水沖洗至黏膜表面粘液消失，以2.5%戊二醛固定液固定2 h，用0.2 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液浸洗3次，每次15 min。再用1%鋨酸固定2 h，用0.2 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液浸洗3次，每次15 min。常規(guī)梯度脫水，臨界干燥0.5 h后以離子濺射噴金，采用掃描電鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般癥狀觀察結(jié)果

造模3 d后模型組大鼠出現(xiàn)撓抓口部，觀察大鼠咽部，出現(xiàn)充血、腫脹，飲水增多，食量下降，自發(fā)性活動(dòng)減少等現(xiàn)象，而正常組大鼠咽部黏膜形態(tài)正常、顏色淡紅，未見(jiàn)明顯異常分泌物，正常飲水、飲食以及活動(dòng)；給藥2 d后，復(fù)方扁咽寧高、中、低劑量組大鼠咽部紅腫及動(dòng)物搔抓情況出現(xiàn)不同程度的減輕，且高、中劑量組療效優(yōu)于低劑量組，6 d后基本痊愈；而模型組大鼠在5 d左右癥狀有輕微改善。研究結(jié)果表明復(fù)方扁咽寧高、中劑量可加快急性咽炎的恢復(fù)進(jìn)程。

2.2 血清中TNF-α以及IL-1β含量測(cè)定結(jié)果

與正常組相比，模型組、低、中、高劑量組血清中TNF-α及IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，提示本實(shí)驗(yàn)氨水誘導(dǎo)的急性咽炎模型大鼠出現(xiàn)了炎性介質(zhì)的分泌，出現(xiàn)了呼吸道的炎癥感染；與模型組相比，復(fù)方扁咽寧低、中、高劑量組血清中TNF-α及IL-1β含量顯著降低(P<0.05)，且中、高劑量組血清中TNF-α及IL-1β含量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)，提示高劑量和中劑量復(fù)方扁咽寧加速急性咽炎康復(fù)的作用可能與降低血清中TNF-α及IL-1β的釋放有關(guān)。

Group TNF-α IL-1βControl group28.3429±2.754549.8086±5.5965Model group56.0467±5.9373*98.8217±8.9509*Low dose group50.2033±3.0434*#84.9700±6.1702*#Middle dose group41.7817±3.1716*#▲59.7317±4.3938*#▲High dose group40.4400±2.7818*#▲63.5817±6.6979*#▲

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;

▲P<0.05vslow dose group

2.3 氣管及肺組織病理樣本觀察結(jié)果

對(duì)肺組織形態(tài)的觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無(wú)明顯增生，肺泡腔清晰，肺泡間隔均勻一致，未見(jiàn)言行細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)；模型組肺泡間隔出現(xiàn)明顯增寬，肺泡壁斷裂融合，部分肺泡腔出現(xiàn)萎縮陷，其內(nèi)充滿(mǎn)淡紅色水腫液，肺泡間隔內(nèi)見(jiàn)大量多形核中性白細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張、出血，血管周?chē)梢?jiàn)水腫液形成水腫套(圖1B)；低劑量組泡出現(xiàn)明顯增寬或萎縮，肺泡壁斷裂融合，部分肺泡腔出現(xiàn)萎縮陷，肺泡間隔內(nèi)可見(jiàn)大量中性白細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)管的充血現(xiàn)象較明顯，血管周?chē)梢?jiàn)水腫液形成水腫套(圖1C)；中劑量組肺泡腔結(jié)構(gòu)較為清晰完整，肺泡間隔內(nèi)中性白細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)有改善，未見(jiàn)明顯毛細(xì)管充血、擴(kuò)張和出血，血管周?chē)[液形成水腫套數(shù)量明顯減少(圖1D)；高劑量組肺泡腔結(jié)構(gòu)較為清晰完整，偶見(jiàn)中性白細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯毛細(xì)管充血、擴(kuò)張和出血，偶見(jiàn)血管周?chē)[液形成水腫套(圖1E)。

Fig.1HE results of lung tissues (×400)

A: Normal group; B: Model group; C: Low dosage group; D: Middle dosage group; E: High dosage group

對(duì)肺支氣管的形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，正常組支氣管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，管腔內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞及纖維蛋白等滲出物，肺泡間隔清晰、未見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血現(xiàn)象，肺泡結(jié)構(gòu)完整(圖2A)；模型組支氣管上皮細(xì)胞排列極其紊亂，表面有大量粘液，杯狀細(xì)胞增生明顯，肺間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔增寬，其內(nèi)含出大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、纖維蛋白和水腫液，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，空肺泡數(shù)量明顯減少，肺實(shí)質(zhì)增多(圖2B)；低劑量組支氣管腔上皮細(xì)胞損傷較輕，少量上皮細(xì)胞排列紊亂，腔內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞及滲出液，部分肺泡間隔增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺實(shí)質(zhì)稍增多，空肺泡有所減少(圖2C)；中劑量組支氣管腔上皮細(xì)胞排列較完整，偶見(jiàn)上皮細(xì)胞排列紊亂，腔內(nèi)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞及滲出液減少，偶見(jiàn)肺泡間隔增寬，偶見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺實(shí)質(zhì)稍增多，空肺泡有所減少(圖2D)；高劑量組支氣管腔上皮細(xì)胞排列較完整，偶見(jiàn)上皮細(xì)胞排列紊亂，尚未壞死脫落的纖毛排列恢復(fù)正常，支氣管腔內(nèi)壞死脫落物、炎癥細(xì)胞基本吸收，有少量滲出液，肺泡間隔毛細(xì)血管未見(jiàn)明顯擴(kuò)張充血，肺實(shí)質(zhì)逐漸減少，偶見(jiàn)空肺泡(圖2E)。

Fig.2HE results of bronchus tissues in lung(×200)

A: Normal group; B: Model group; C: Low dosage group; D: Middle dosage group; E: High dosage group

2.4 氣管纖毛樣本超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖3。正常組氣管纖毛結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，濃密(圖3A)；模型組纖毛排列紊亂，出現(xiàn)大量纖毛倒伏、水腫、融合、變粗，甚至呈“蚯蚓”狀，偶見(jiàn)纖毛脫落、壞死，多數(shù)杯狀細(xì)胞表面粘液增多、輪廓模糊，微絨毛結(jié)構(gòu)較模糊(圖3B)；低劑量組纖毛排列較紊亂，出現(xiàn)纖毛倒伏、水腫、融合、變粗，甚至呈“蚯蚓”狀，部分杯狀細(xì)胞表面粘液增多、輪廓模糊，微絨毛輪廓較清晰，有輕微粘連(圖3C)；中劑量組纖毛受損程度較輕，可見(jiàn)纖毛排列較整齊，少量纖毛倒伏，偶見(jiàn)聚集和融合現(xiàn)象，未見(jiàn)水腫和滲出，纖毛形態(tài)基本正常，少量杯狀細(xì)胞表面粘液增加，微絨毛形態(tài)正常、清晰可見(jiàn)(圖3D)；高劑量組纖毛形態(tài)基本正常，排列較整齊、致密，偶見(jiàn)纖毛倒伏，杯狀細(xì)胞輪廓清晰，偶見(jiàn)少量粘液附著于其表面(圖3E)。

Fig.3SEM graphs of trachea cilia (×2 000)

A: Normal group; B: Model group; C: Low dosage group; D: Middle dosage group; E: High dosage group

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明流感病毒、副流感病毒、柯薩奇病毒、腺病毒、鼻病毒、葡萄球菌、甲型鏈球菌、肺炎雙球菌等病毒和細(xì)菌感染或高溫、粉塵、煙霧等物理或化學(xué)因素刺激等均是引起急性咽炎的誘因[2,6-10]。復(fù)制或建立成功的急性咽炎動(dòng)物模型是研究治療咽炎及上呼吸道炎癥感染的藥物療效和作用機(jī)制的前提保證，但目前國(guó)外報(bào)道較少。國(guó)內(nèi)目前較常用的模型主要包括氨水直接噴霧法、氨水定點(diǎn)定量涂抹法、細(xì)菌注射感染法等[11-15]，考慮到細(xì)菌注射感染法制作模型相對(duì)較困難，氨水定點(diǎn)定量涂抹法模型維持時(shí)間較短，均不利于開(kāi)展中藥復(fù)方制劑的藥理學(xué)研究，故本研究采用了氨水直接噴霧法復(fù)制急性咽炎模型，所建立的模型出現(xiàn)了粘液分泌增多、咽部黏膜充血、腫脹等與急性咽炎臨床表現(xiàn)相似度較高，表明本模型較為成功；但同時(shí)本研究所建立的模型出現(xiàn)了一定程度的口腔灼傷和肺部損傷，提示該模型可能也可以作為口腔潰瘍和慢性咽炎動(dòng)物模型，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。

復(fù)方扁咽寧由玄參、桔梗、麥冬、重樓等組成，以苦寒之藥為主，配伍甘寒之品，佐以少量辛溫之藥，重在清熱解毒，清肺胃之熱且兼顧滋陰.本研究結(jié)果顯示，復(fù)方扁咽寧可明顯改善急性咽炎模型大鼠的一般狀態(tài)，緩解急性咽炎模型大鼠支氣管及肺組織炎癥反應(yīng)，加速急性咽炎的康復(fù)過(guò)程。

TNF-α是急性炎癥相關(guān)重要的炎癥指標(biāo)，是由活性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能活化內(nèi)皮細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集、活化和炎癥介質(zhì)的釋放，加重炎癥癥狀。IL-1β是重要的促炎因子，與TNF-α的釋放相互促進(jìn)，在急性肺組織損傷中，TNF-α起著始動(dòng)作用，IL-1β具有協(xié)同作用[17,18]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方扁咽寧可顯著降低炎癥大鼠血清中 IL-1β和 TNF-α的含量，改善支氣管及肺的組織形態(tài)。綜上，本研究從藥效學(xué)上驗(yàn)證了復(fù)方扁咽寧對(duì)氨水誘導(dǎo)的急性咽炎模型大鼠具有良好的治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制血清IL-1β和TNF-α的釋放等有關(guān)。