β片層阻斷肽H102對AD小鼠識別記憶能力和腦內(nèi)AMPK-mTOR自噬相關通路的影響*

單尚然， 蔣 方， 徐淑梅

(天津醫(yī)科大學生理學教研室， 天津 300070)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關、進行性發(fā)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。該病起病隱匿，由多因素引起，學習記憶力減退、認知功能障礙，最終導致生活自理能力完全喪失，是癡呆最常見的臨床表現(xiàn)形式[2]。AD的主要病理學改變是β-淀粉樣蛋白在神經(jīng)元細胞外異常沉積形成的老年斑(senile plaques, SP)和細胞內(nèi)自我聚集的tau蛋白的過磷酸化所形成的神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)。隨著病程的發(fā)展，大腦被這些老年斑和神經(jīng)纖維纏結影響，造成學習和記憶力的的衰退[3]。關于阿爾茨海默癥的致病機理，目前仍有爭論，有多個學說的提出。目前β 樣淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein，Aβ) 級聯(lián)學說得到廣大學者的廣泛認可，作為老年斑主要成分的Aβ 可能是AD 的原發(fā)性病理因子，是影響AD發(fā)病的核心因素[4]。本課題組的β片層阻斷肽H102是專門針對Aβ設計的治療老年癡呆的新型候選藥物，分子組成為十肽水溶性藥物，它能夠有效抑制 Aβ 的折疊和聚集，減少 Aβ 的含量，制約Aβ對神經(jīng)元造成損傷，從而影響下游病理過程[5]。本課題組前期已經(jīng)證實 β 片層阻斷肽 H102影響Aβ的生成，包括H102 能夠與 β 淀粉樣肽相結合，抑制 Aβ 的折疊和聚集； H102 參與 APP 的代謝，影響Aβ 的生成等。但是對H102是否影響Aβ清除的自噬相關通路未有涉及，因此設計本實驗觀察H102對激活自噬通路的作用。

在真核細胞中，自噬是一種正常的調(diào)節(jié)性回收衰老細胞組分、清除結構或功能異常細胞器或蛋白聚合物的細胞生理過程。在生理情況下，細胞維持一種較低水平的自噬[6]。當體內(nèi)積累過多異常折疊的蛋白質(zhì)時，就會激活相關自噬通路來加速對異常蛋白的清除。自噬作為細胞內(nèi)清除異常折疊蛋白質(zhì)、受損細胞器和其他有害物質(zhì)的主要途徑，對β 淀粉樣肽產(chǎn)生和清除的平衡具有重要作用[7]。近年來，大量研究表明腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)不僅在維持細胞能量平衡上發(fā)揮重要作用，還可以通過細胞內(nèi)多條通路影響細胞的自噬過程，其中最主要的通路就是胞漿內(nèi)的AMPK-mTOR 信號通路，這一通路得到廣泛研究[8]。本研究旨在觀察H102 對AMPK-mTOR自噬通路相關蛋白的影響，以探討H102 是否可以通過激活自噬途徑減少Aβ，對AD起到一定的治療的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

6月齡APP/PS1雙轉基因AD雄性小鼠30只，同月齡同背景的C57BL/6J雄性小鼠15只，體重(30.0±1.6)g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學動物科學部SPF級實驗動物中心。β片層阻斷肽H102由上海吉爾生化有限公司采用固相合成法合成。 JLbehv-1新物體識別系統(tǒng)購自北京伯豪生物技術有限公司；免疫組化中DAB試劑盒、即用型SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，生物素二抗試劑盒購自北京鼎國生物公司；Western blot中β-actin抗體購自北京中杉金橋生物公司，P-AMPK抗體購自CST公司，P-mTOR抗體、LC3Ⅱ/Ⅰ抗體購自abcam公司。

1.2 動物分組及給藥方法

將30只6月齡的APP/PS1雙轉基因雄性AD小鼠隨機分為AD組和H102干預組(n=15)。將同月齡同背景飼養(yǎng)下的15只C57BL/6J雄性小鼠設為對照組。H102干預組的小鼠每天同一時間段經(jīng)鼻腔給予H102溶液5 μl(5.8 mg/kg)，對照組和AD組小鼠每日給予等量的的空白輔料溶液 (0.5%殼聚糖、0.1%BSA)。持續(xù)給藥30 d 。

1.3 新物體識別實驗

連續(xù)給藥30 d后，進行新物體識別實驗。實驗共分3 d完成，分別為適應、熟悉、測試三階段。第1日將各小鼠放入敞箱中自由活動10 min。第2日在敞箱中放入相同、位置對稱的兩個物體，讓其自由活動5 min進行探索和學習。第3日將其中一個物體換成顏色和形狀均不同的物體，步驟如第2日繼續(xù)進行探索和學習。系統(tǒng)自動記錄每一只小鼠對兩個物體的識別時間，并對生成的數(shù)據(jù)進行實驗分析。熟悉階段主要是排除位置對實驗結果的影響，位置偏愛指數(shù)用LI表示，測試階段是測試小鼠在對熟悉物體記憶的基礎之上對新物體的探索時間，新物體識別指數(shù)用RI表示。

1.4 腦組織樣本的制備

新物體識別實驗結束后，用25%的烏拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注至肝肺透明，然后處死在冰上取腦，一半腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，一半腦組織分離皮層和海馬放入液氮中后移入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫組織化學染色

甲醛固定過的腦組織經(jīng)修片、脫水、透明、浸蠟、切片進行以下免疫組化實驗。脫蠟復水后去離子水浸泡，3%H2O2室溫孵育，枸櫞酸抗原修復液進行抗原修復。5%BSA封閉后，滴加稀釋一定的比例的一抗(P-AMPK 1∶400、P-mTOR 1∶100、LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶300)后，4℃過夜，滴加生物素標記的二抗工作液37℃避光孵育30 min，辣根酶標記物(SABC)工作液37℃避光孵育30 min，DAB顯色劑顯色，鏡下控制時間，蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。陰性對照組用PBS代替一抗進行染色，其余步驟同上。在倒置成像系統(tǒng)下觀察并拍攝相同層次的海馬和皮層，用image-proplus 6.0軟件對染色結果進行光密度(optical density, OD)分析。

1.6 Western blot實驗

于-80℃冰箱中取出海馬和皮質(zhì)組織，提取總蛋白，BCA 法定量測定蛋白濃度后調(diào)定各組蛋白為等濃度，加適量上樣緩沖液，煮沸變性5 min。5% ～ 12%分離膠5%濃縮膠電泳蛋白分離后進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(P-AMPK 1∶1 000、P-mTOR 1∶10 000、LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶3 000)，4℃過夜，加入稀釋的二抗(1∶10 000)，室溫下孵育2 h，然后ECL發(fā)光顯色，蛋白條帶曝光。用emageJ軟件分析所得條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 新物體識別記憶能力測試結果

實驗中各組小鼠熟悉階段中的位置偏愛指數(shù)以及測試階段中的新物體識別指數(shù)如表1所示，實驗結果說明各組小鼠的位置偏愛指數(shù)均在50%左右，說明我們可以排除位置這個因素對測試階段實驗結果的影響；從實驗數(shù)據(jù)中我們能夠看出，與對照組相比，AD 組新物體識別指數(shù)顯著降低(P<0.05)，與AD 組相比，H102 干預組新物體識別指數(shù)顯著提高(P<0.05，表1)。

Group LIRIControl51.27±6.8669.68±8.91AD52.34±7.2452.24±7.98 *H10251.58±8.2962.23±8.21#

LI: Location preference index; RI: Recognition index; AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsAD

2.2 免疫組化DAB染色法測定AMPK-mTOR通路相關蛋白的表達

對P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白免疫組化染色結果顯示，與對照組相比，AD組小鼠腦內(nèi)P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白OD值顯著降低(P<0.05),與AD組相比，H102干預組小鼠腦內(nèi)P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白光密度顯著提高(P<0.05)。對P-mTOR蛋白，與對照組相比，AD組小鼠腦內(nèi)P-mTOR蛋白光密度顯著提高(P<0.05)，與AD組相比，H102干預組小鼠腦內(nèi)P-mTOR蛋白光密度顯著降低(P<0.05,表2，圖1，圖1.1，圖1.2見彩圖頁Ⅰ，圖1.3見彩圖頁Ⅴ)。

2.3 Western blot 測定AMPK-mTOR通路相關蛋白的表達

Western blot結果顯示，與對照組比較，AD組小鼠蛋白條帶明顯變細，顏色變淺，P-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AD組相比，H102干預組小鼠腦內(nèi)P-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加，蛋白條帶明顯變粗，顏色變深，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05); 對P-mTOR蛋白，與對照組比較，AD組小鼠蛋白條帶明顯增粗，顏色加深， P-mTOR蛋白蛋白的表達量顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AD組相比，H102干預組小鼠腦內(nèi)P-mTOR表達明顯降低，蛋白條帶明顯變細，顏色變淺，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2.1、2.2，圖3)。

Fig.2.1Expressions of P-AMPK, P-mTOR, LC3Ⅱ/Ⅰ ratio level in mice hippocampus

A: Control; B: AD; C: H102; AD: APP /PS1 double Transgenic

Fig.2.2Expressions of P-AMPK, P-mTOR, LC3Ⅱ/Ⅰ ratio level in mice cortex

A: Control; B: AD; C: H102; AD: APP /PS1 double Transgenic

GroupP-AMPKHippocampusCortexP-mTORHippocampusCortexLC3HippocampusCortexControl73.05±9.1589.12±10.6569.96±7.3686.75±11.1679.03±7.5663.09±12.43AD57.93±10.75*74.91±12.72*90.33±8.36*96.87±10.07*56.52±10.16*43.22±7.01*H10285.36±7.55#83.08±8.43#48.62±3.32#67.74±11.40#94.21±8.00#82.09±9.95#

AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsAD

AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05,**P<0.01

3 討論

大腦皮層、海馬的神經(jīng)元缺失是阿爾茨海默病(AD)的主要病理結果[9]，所以我們本課題的取材是小鼠大腦的皮層和海馬。AD的主要臨床特征是學習記憶力減退、認知功能障礙。新物體識別記憶能力測試結果表明，H102干預組的新物體識別指數(shù)要明顯高于AD組，提示H102對于AD 的預防和治療具有一定的積極作用。

大量研究表明，Aβ在細胞外的異常聚集形成SP[10]，是AD的重要物質(zhì)，故清除異常聚集的Aβ至關重要，這個過程主要就是自噬[11]，H102 在小鼠腦區(qū)通過自噬來清除Aβ是本課題想要探討的另一內(nèi)容。自噬過程包括自噬泡的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合三個階段[12]。腺苷酸活化蛋白激酶( AMP-activatedprotein kinase，AMPK)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是自噬過程中關鍵的蛋白質(zhì)分子。在自噬通路中AMPK-mTOR通路，已經(jīng)得到廣泛的研究[8]。AMPK是三聚體復合體，由催化亞單位α 和調(diào)節(jié)亞單位β 和γ 組成。在腦組織中α亞型較為豐富[13]。AMPK是能量感受器，主要協(xié)調(diào)代謝和能量的需要，大量研究表明AMPK作為哺乳動物細胞代謝傳感器參與神經(jīng)變型性變的調(diào)控[14]。免疫組化和Western blot 實驗結果均表明， H102能夠顯著活化AMPK，這可能是因為神經(jīng)元AMPK信號激活主要靠胞漿AMP和Ca2+水平的增高，而H102多肽本質(zhì)是十種氨基酸組成，可以作為AMPK的激動劑，來通過活化AMPK誘導自噬，清除異常聚集的Aβ。作為自噬調(diào)控的中心分子， mTOR能夠調(diào)節(jié)細胞周期及細胞自噬等多種細胞進程。可表現(xiàn)出＂活性開關＂樣的作用，激活或抑制自噬通路，保持生理環(huán)境的動態(tài)平衡。Park 等[15]證明，西洛他唑能激活AMPK，降低mTOR的磷酸化水平，從而抑制mTOR 活性，促進自噬體形成，減少Aβ 的積累，發(fā)揮中樞神經(jīng)保護作用。本實驗結果顯示，AD小鼠腦內(nèi)m-TOR過度磷酸化，自噬出現(xiàn)障礙，而H102干預組，P-mTOR顯著降低，表明H102可能通過激活AMPK抑制mTOR 活性來誘導自噬，加速Aβ的清除。LC3 是自噬標志物，當自噬泡成熟時，LC3-I 轉變?yōu)長C3-II( 即自噬體膜型) ，LC3-II /I 比值的大小被廣泛用于評估自噬激活的程度[16]。本實驗中，AD組LC3Ⅱ/Ⅰ的比值很小，提示AD小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)自噬障礙，H102可顯著提高AD小鼠腦內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，表明H102干預組能夠重新激活自噬通路加速對Aβ的清除作用。

由此可知，在AMPK-mTOR通路中，H102作為多肽分子，可以通過激活AMPK，抑制mTOR來誘導自噬，加速對Aβ的清除作用，改善AD小鼠的學習記憶能力，達到對AD小鼠治療的目的。