肉雛鵝源多殺性巴氏桿菌分離鑒定與致病性試驗

劉 燕

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院,河南 中牟 451450)

多殺性巴氏桿菌(Pm)是畜禽養(yǎng)殖中常見病原菌之一,該菌可以感染多種動物及人,動物感染后可以引起禽霍亂、豬肺疫和牛出血性敗血癥等多種疾病[1]。鵝巴氏桿菌病該病由多殺性巴氏桿菌引起的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病,又稱鵝霍亂,該病可以感染不同日齡的鵝,尤其對雛鵝較易感,多數(shù)呈急性敗血癥型,具有發(fā)病急、死亡快特點,發(fā)病率高達35%以上,死亡率高達70%以上,當(dāng)與其他疾病混合感染后,其死亡更高,該病成為養(yǎng)鵝業(yè)主要傳染性疾病之一,嚴(yán)重影響著我國養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展[2-4]。目前,對多殺性巴氏桿菌沒有有效的疫苗進行預(yù)防,主要使用抗菌藥物進行預(yù)防與治療,在養(yǎng)殖過程中由于抗菌藥物的不合理使用,多殺性巴氏桿菌多重耐藥越來越嚴(yán)重,應(yīng)引起重視。

2018年9月,中牟地區(qū)某一肉鵝規(guī)?；B(yǎng)殖場,14日齡肉雛鵝出現(xiàn)呼吸困難、腹瀉、個別呈現(xiàn)急性死亡。無菌采集病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織中分離到1株病原菌,被鑒定為多殺性巴氏桿菌,本試驗對分離的多殺性巴氏桿菌進行血清型鑒定、致病性檢測及耐藥性分析,為該病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 中牟地區(qū)某一肉鵝規(guī)?；B(yǎng)殖場,14日齡肉雛鵝出現(xiàn)呼吸困難、腹瀉、個別呈現(xiàn)急性死亡。無菌采集病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織。

1.2 主要試劑與儀器 MH瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯,均購自北京陸橋生化試劑有限公司；美蘭染色液試劑盒,購自青島海博生物技術(shù)有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條,購自bioMerieuxsa公司；小牛血清,購自四季青公司；藥敏紙片,購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；DL-2-000 Marker,購自北京中科瑞泰生物有限公司；2×Taq Marker Mix,購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)(VITEK2型)由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；7%綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)基由本實驗自制由本實驗提供。

1.3 實驗動物 1日齡健康肉雛鵝60只,中牟地區(qū)某一肉鵝規(guī)模化養(yǎng)殖場提供,在河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院實習(xí)基地養(yǎng)殖至14日齡進行試驗。

1.4 細菌分離與培養(yǎng) 采集病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織無菌條件下接種于7%綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng),37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h,選取單個優(yōu)勢菌落接種劃含有10%小牛血清的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)后,挑取單個的優(yōu)勢菌落接種在含10%小牛血清營養(yǎng)肉湯中純化培養(yǎng),取純化培養(yǎng)的分離菌株進行美藍染色鏡檢。

1.5 細菌的生化特性試驗 取純化培養(yǎng)的分離菌株,通過比濁法調(diào)整菌液濃度為0.5個麥?zhǔn)蠞岫?按照說明加到ID32E腸道菌鑒定試劑條中進行培養(yǎng),用全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)對分離菌株進行生化試驗。

1.6 細菌的PCR鑒定與測序 參考文獻[5],根據(jù)多殺性巴氏桿菌基因序列設(shè)計特異性引物Kmt：P1 5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′,P2 5′-GCTGTAAACGAACTGCCAC-3′由上海生工生化有限公司合成；預(yù)期擴增片段大小為457 bp。采用水煮法提取分離菌株的基因組DNA,以提取的基因組DNA為模板,多殺性巴氏桿特異性引物經(jīng)行PCR鑒定。PCR擴增反應(yīng)體系(50 μL)：2 × Taq Marker Mix 25 μL,上、下游引物各 2 μL,DNA 模板 2 μL,ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s,59.5℃退火50 s,72℃延伸50 s,72℃中延伸10 min,共30個循環(huán)。將目的基因片段回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定,測序結(jié)果與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中登錄參考基因序列進行同源性比較。

1.7 細菌致病性試驗 參考文獻[6]設(shè)計致病性試驗,并計算LD50。選擇體重相近健康肉雛鵝60只隨機分成6組,每組10只,1～5組的每只試驗肉鵝腹腔注射分離菌株菌液0.2 mL,1～4組腹腔注射分離菌株菌液濃度分別為1.0×104CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0 × 106CFU/mL、1.0 × 107CFU/mL、1.0×108CFU/mL,6組為空白對照組給予等量的無菌的生理鹽水,攻毒12 h后觀察7 d,并記錄每個試驗組肉鵝發(fā)病情況及死亡數(shù)據(jù),對死亡的試驗鵝鴨進行細菌學(xué)鑒定,用改良寇氏法計算分離菌株的LD50。

1.8 細菌的血清型鑒定 參考文獻[7],設(shè)計多殺性巴氏桿血清型基因序列設(shè)計引物(表1),由上海生工生化有限公司合成,以提取的基因組DNA為模板,用PCR方法鑒定多殺性巴氏桿血清型。

表1 多殺性巴氏桿血清型引物序列設(shè)計

1.9 藥敏試驗 藥敏試驗按照美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進行操作和結(jié)果判斷[8]。

2 結(jié)果分析

2.1 細菌分離與培養(yǎng)結(jié)果 分離菌株7%的綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)基長出灰白色的、圓形的、濕潤的、均勻一致的露珠樣小菌落；在含10%小牛血清普通營養(yǎng)瓊脂上可見灰白色、圓形的菌落,在不含10%小牛血清普通營養(yǎng)瓊脂生長貧瘠。美蘭染色鏡檢可見分離菌株呈卵圓形,中央不易著色兩極濃染球桿菌(見圖1)。

圖1 分離菌美藍染色鏡檢結(jié)果 (1 000×)

2.2 細菌的生化鑒定結(jié)果 分離菌株分解葡萄糖、果糖、單奶糖、蔗糖和甘露糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；可產(chǎn)生硫化氫,能形成靛基質(zhì),MR和V-P試驗均為陰性；接觸酶和氧化酶試驗均為陽性。經(jīng)全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)檢測分析,鑒定結(jié)果為多殺性巴氏桿菌,結(jié)果見表2,評定結(jié)果合格率為100.0%。

表1 生化試驗鑒定結(jié)果

2.3 細菌的PCR鑒定與測序 用多殺性巴氏桿菌特異性引物對分離菌株Kmt 2基因PCR擴增出大約為457 bp左右的的目的條帶,與報道的一致(見圖2)。將分離菌株的測序結(jié)果進行拼接后與GenBank中登錄的多殺性巴氏桿菌基因序列同源性在98.9%～100%之間,因此,分離菌株被鑒定為多殺性巴氏桿菌。

圖2 分離菌株Kmt基因PCR鑒定結(jié)果

2.4 細菌致病性試驗結(jié)果 1-5組試驗試驗肉鵝在攻毒后的24 h～96 h,出現(xiàn)不同程度死亡,對死亡的試驗肉鵝進行細菌學(xué)鑒定,在死亡的試驗肉鵝體內(nèi)分離到了大腸桿菌菌,直到試驗結(jié)束(7d),對照組試驗肉鵝健康存活,1-5組死亡率分別為40%、70%、90%、100%、100%。用改良寇氏法計算致病性多殺性巴氏桿菌的LD50為5.86×106CFU/mL。

1.5 細菌的血清型鑒定結(jié)果 用多殺性巴氏桿菌血清型引物對分離菌血清型進行PCR檢測,分離菌株擴增出A血清型大約為1058 bp左右的的目條帶(圖3),測序結(jié)果與與GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的多殺性巴氏桿菌莢膜A型菌株參考菌株同源性為99.9%,分離菌為多殺性巴氏桿菌莢膜型A型。

圖3 多殺性巴氏桿菌血清型PCR鑒定結(jié)果

2.5 藥敏試驗結(jié)果 由表2可知,從肉雛鵝體內(nèi)分離到的致病性多殺性巴氏桿菌對頭孢曲松、頭孢噻呋、強力霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素6種藥物高度敏感；對新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、大觀霉素等5種藥物中度敏感；對氨芐西林、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、紅霉素、多粘菌素等5種藥物耐藥。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

近幾年,隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,肉鵝養(yǎng)殖數(shù)量越來越多,國內(nèi)關(guān)于鵝巴氏桿菌病的報道逐漸增多,該病發(fā)病急、死亡快,其發(fā)病率和死亡率都很高特點,成為危害養(yǎng)鵝業(yè)主要細菌性傳染疾病之一[9]。本試驗從中牟地區(qū)某一肉鵝規(guī)模化養(yǎng)殖場中14日齡病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織中分離到1株病原菌,被鑒定為多殺性巴氏桿菌,通過人工感染肉雛鵝驗證其致病性,結(jié)果顯示,從肉雛鵝體內(nèi)分離到的多殺性巴氏桿菌對14日齡的雛鵝具有很強的致病性,其LD50為5.86×106CFU/mL。本試驗分離的肉鵝源致病性多殺性巴氏桿菌致病性均高楊楠等[6]、張召興等[10]報道的?？赡芘c分離的區(qū)域有關(guān)。巴氏桿菌傳播途徑廣泛,與外界環(huán)境的有很大關(guān)系,當(dāng)外界條件該病時,可以誘發(fā)該病發(fā)生與流行。在肉鵝的養(yǎng)殖過程中應(yīng)該引起重視。

多殺性巴氏桿菌抗菌結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其中莢膜抗原主要包括A、B、D、E和F5種,脂多糖抗原有16種,不同地區(qū)不同的宿主流行的血型也存在差異性。本試驗結(jié)果顯示,分離到肉鵝源致病性多殺性巴氏桿菌莢膜抗原血清型為A型。許多研究鵝源多殺性巴氏桿菌莢膜抗原血清型為A型。莢膜抗原血A型多殺性巴氏桿菌可能成為鵝源多殺性巴氏桿菌流行的主要血清型。在肉鵝養(yǎng)殖過程中,沒有用多殺性巴氏桿菌多價疫苗進行預(yù)防,導(dǎo)致該病的發(fā)生與流行,臨床中主要用抗菌藥物進行防控,抗菌藥物不合理使用,導(dǎo)致嚴(yán)重的耐藥性,降低治療效果。本試驗藥敏試驗結(jié)果表明,分離菌株對對頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星等6種藥物高度敏感；對其他藥物有不同的程度耐藥性。因此,當(dāng)發(fā)生該病時,應(yīng)該選擇敏感藥物合理使用,減少抗藥性產(chǎn)生,同時還要加強平時的飼養(yǎng)管理,注意養(yǎng)殖環(huán)境中的消毒。