規(guī)模化豬場(chǎng)仔豬圓環(huán)病毒2型與3型混合感染的檢測(cè)與控制

朱秀高,李艷青,史 紅,徐偉超,方 浩

(1.武漢回盛生物科技股份有限公司,湖北 武漢 430042；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193 3.濰坊科技學(xué)院生物研發(fā)中心 ,山東 壽光 262700；4.回盛生物豬病研究院 ,湖北 武漢 430042)

豬圓環(huán)病毒(PCV)感染在豬場(chǎng)普遍存在,自出現(xiàn)以來,雖然有1型和2型兩種基因型,但一直以2型為主致病,臨床表現(xiàn)多以斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)為主。2016年P(guān)han等報(bào)道PCV3型在美國引起母豬繁殖障礙和皮炎腎病問題[1],何其蓋等隨后報(bào)道了PCV 3型在國內(nèi)豬場(chǎng)的發(fā)病情況[2]。從對(duì)病料的回顧性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),PCV 3型在國內(nèi)存在已有較長(zhǎng)時(shí)間,且很多出現(xiàn)PCV 3型感染的豬場(chǎng)都已經(jīng)免疫過PCV 2型疫苗[3]。因此3型的出現(xiàn)加重了豬場(chǎng)PCV防控的壓力。

2017年9月,山東某存欄1 300頭母豬豬場(chǎng)反饋該場(chǎng)連續(xù)3批體重40 kg左右的生長(zhǎng)豬出現(xiàn)以外觀漸進(jìn)性消瘦、皮膚丘疹樣病變(見中插彩版圖1),剖檢以淋巴結(jié)腫大、肺間質(zhì)增寬為主要特征的疾病(見中插彩版圖2、3),發(fā)病率為15%,死亡率不到1%。經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)診斷與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診為PCV 2型和PCV 3型混合感染。

圖1 發(fā)病豬消瘦、皮膚丘疹樣凸起

圖2 發(fā)病豬淋巴結(jié)腫脹

圖3 發(fā)病豬肺間質(zhì)增寬、出血及膠凍樣滲出

1 材料與方法

1.1 材料 檢測(cè)樣品：A.組織病料：現(xiàn)場(chǎng)宰殺病豬3頭,分別取其脾臟、淋巴結(jié)和肺臟組織凍存；B.唾液：用滅菌后的棉繩采集2個(gè)發(fā)病豬圈的圈內(nèi)混合唾液樣本2份凍存；C.血清：經(jīng)前腔靜脈采集發(fā)病豬血液15份,離心分離血清凍存；所有樣品標(biāo)記凍存后,送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR診斷,測(cè)定樣品中是否存在PCV。

主要檢測(cè)試劑：Transgen EasyPure Viral DNA/RNA Kit。

主要檢測(cè)儀器：BIO-RAD PCR儀 S1000、天能1600凝膠成像系統(tǒng)。

引物：根據(jù)GenBank中公布的PCV相關(guān)全基因組序列和Ku等報(bào)道[2],分別設(shè)計(jì)針對(duì) PCV2與PCV3 的引物：PCV2-F：5′-AAGGGCTGGGTTATGGTATGv3′、 PCV2-R： 5′-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3′、 PCV3-F：5′-TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACG-3′、PCV3-R：5′-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段分別為353 bp和649 bp。

1.2 方法 將組織病料用無菌生理鹽水沖洗、研磨成組織懸液,反復(fù)凍融3次,6 000 r/min離心30 min取上清液,0.22 μm濾膜除菌后使用；血清和唾液經(jīng)6 000 r/min離心30 min取上清,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后使用。處理的樣品液按試劑盒推薦方法提取 DNA后進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性 5min、94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,30 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與處理

2.1 結(jié)果 電泳后的凝膠圖像(見中插彩版圖4)顯示,1、3、5、7、11、13、15、17 號(hào)和 19 號(hào)樣品為PCV2陽性,10號(hào)和14號(hào)樣品為PCV3陽性。

圖4 送檢樣品PCV檢測(cè)結(jié)果

綜合臨床、剖檢及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果,確診該豬場(chǎng)發(fā)病是由PCV2和PCV3混合感染造成。

2.2 處理 針對(duì)確診結(jié)果,建議豬場(chǎng)及時(shí)采取“增強(qiáng)抵抗力+抗病毒+防止繼發(fā)感染+防應(yīng)激”的措施,在生長(zhǎng)豬階段,每噸飼料添加茯苓多糖散500 g、10%磺胺二甲嘧啶+10%酒石酸泰樂菌素1 500 g和復(fù)方維生素+氨基酸+活菌添加劑2 000 g,連用15 d；母豬群及時(shí)間隔1個(gè)月免疫2次PCV 2型疫苗,飼料中添加茯苓多糖散500 g/噸,每月1次,每次15 d,連用3個(gè)月。

豬場(chǎng)反饋處理后5 d大群采食量開始上升、活動(dòng)頻率加大,10 d后被毛開始變得柔順有光澤、消瘦情況逐步緩解,皮膚上的疹塊逐步消退。

3 分析與建議

通過查閱該豬場(chǎng)的生產(chǎn)記錄,并與生產(chǎn)各崗位人員交流發(fā)現(xiàn),發(fā)病仔豬的母豬在5月份的圓環(huán)疫苗普免中由于人為因素出現(xiàn)漏免,造成免疫空白長(zhǎng)達(dá)8個(gè)月,使得豬群特別是出生仔豬缺少母源抗體的保護(hù)。另一方面,該豬場(chǎng)7月份引入190頭后備母豬40 d左右,場(chǎng)內(nèi)少量經(jīng)產(chǎn)母豬出現(xiàn)了以木乃伊為主要特征的中后期流產(chǎn),懷疑乙腦感染直接采取淘汰措施后再未有新流產(chǎn)病例出現(xiàn),錯(cuò)過了早期發(fā)現(xiàn)PCV潛在感染的機(jī)會(huì)?！奥┟?引種帶毒”兩重因素疊加,造成了本次仔豬的發(fā)病。

雖然豬場(chǎng)自身管理因素是本次發(fā)病的主要原因,但檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的PCV 3型問題應(yīng)引起廣大養(yǎng)豬從業(yè)人員的高度重視。近年來國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)中頻頻出現(xiàn)的“舊病復(fù)發(fā)”問題,如仔豬病毒性腹瀉(PED)、偽狂犬病(PRD)和藍(lán)耳病(PRRS)等,究其主要原因都是出現(xiàn)了新基因型致病毒株,由于現(xiàn)有疫苗對(duì)此類流行毒的交叉保護(hù)力欠佳,導(dǎo)致這些疾病在全國范圍快速暴發(fā),給一線養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大損失。PCV 3型病毒首次報(bào)道后,韓國[4]、意大利[5]、波蘭[6]、巴西[7]和英國[8]等隨后確認(rèn)該國豬群出現(xiàn)了PCV 3型感染,國內(nèi)如河北[9]、山東等13省[10]也檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在PCV 3型感染。根據(jù)國內(nèi)豬場(chǎng)圓環(huán)疫苗的免疫現(xiàn)狀及臨床調(diào)查,很多PCV 3型感染豬場(chǎng)都免疫過PCV 2型疫苗,此外,從基因型分析,PCV 2和PCV 3存在較大差異,進(jìn)化樹中兩者屬于不同分支。因此可以推測(cè)目前使用的PCV 2型疫苗不能給予PCV 3型感染以充分保護(hù),兩者交叉免疫保護(hù)力偏低。在目前尚無PCV 3型疫苗的情況下,豬場(chǎng)在面對(duì)PCV感染時(shí)應(yīng)考慮如何在PCV 2型防控基礎(chǔ)上進(jìn)一步做好PCV 3型的控制,建議可以考慮采取“PCV 2疫苗+中藥增強(qiáng)免疫+防止繼發(fā)感染”組合來進(jìn)行控制。