益氣活血復方抗血栓的作用機制研究

阮灝，胡桃紅，馬曉娟，苗洋，李丹丹，殷惠軍

近年來，很多學者從血栓形成的病理生理角度及中藥藥理的作用機制方面揭示了益氣活血法可以改善血液流變學、調節(jié)循環(huán)、抑制炎性反應、調整免疫功能及機體反應性等[1]。本研究借助頸動脈血栓大鼠模型，應用丹參和西洋參配伍組成益氣活血復方，評價其抗血栓形成作用及其作用機制，以期為課題組后續(xù)的實驗奠定基礎、為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組健康SD大鼠50只，雄性，體重（180±20）g，由北京斯貝福實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0002。動物于實驗室動物房飼養(yǎng)，飲水、飼料充足。室溫（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，實驗室定期消毒。將大鼠隨機分為5組，分別為假手術組（S）、模型組（M）、阿司匹林組（A）、益氣活血復方高劑量組（H）、益氣活血復方低劑量組（L）。益氣活血復方高、低劑量組將供試物分散于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）中，以生藥量計，高劑量組丹參6 g/kg、西洋參2 g/kg，低劑量組丹參1.5 g/kg、西洋參0.5 g/kg；阿司匹林組將阿司匹林原料藥分散于0.5%CMC中，給藥劑量為100mg/kg；假手術組和模型組分別給予0.5%CMC。適應性喂養(yǎng)5 d，預防性給藥7 d后手術，之后連續(xù)干預3周。每周稱重1次以調整給藥劑量。

1.2 藥物及試劑西洋參（吉林易天健藥業(yè)，批號：4258876）、丹參（同仁堂，產地：山東，批號：601002133）、大孔樹脂（D-101，天津興南允能高分子技術有限公司）、乙醇（色譜純，Fisher）。以丹參中丹參酮ⅡA、丹酚酸B作為考察指標，使用乙醇回流提取，藥渣揮干乙醇，再次用水提取，分別得到丹參中脂溶性成分與水溶性成分。以西洋參中人參皂苷Rg1、Rb1、Re總量作為考察指標，使用乙醇回流提取，得到西洋參脂溶性成分。采用大孔樹脂分離手段，分別進行有效物質的純化，分別得到丹參和西洋參有效部位，將所得有效部位按生藥量3：1混合均勻，制成益氣活血復方。阿司匹林原料藥（50782，武漢欣欣佳麗生物科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（151204，安徽山河藥用輔料有限公司）；戊巴比妥鈉（57330，北京化學試劑公司）；血栓素B2（TXB2）ELISA Kit（E02T0025，上海藍基生物科技有限公司）；6-酮-前列腺素1α（6-K-PGF1α）ELISA Kit（E02A0685，上海藍基生物科技有限公司）；抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）ELISA Kit（E02A0895，上海藍基生物科技有限公司）；蛋白C（PC）ELISA Kit（E02O0722，上海藍基生物科技有限公司）；纖溶酶原（PLG）ELISA Kit（E02P0127，上海藍基生物科技有限公司）；內皮素-1（ET-1）ELISA Kit（E02E0040，上海藍基生物科技有限公司）。

1.3 儀器臺式高速冷凍離心機（Sorvall ST 8R，Thermo Fisher）；低速自動平衡離心機（LDZ5-2，北京京立離心機有限公司）；電子天平（ALC-210.3，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；小動物麻醉機（tabletop，北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司）；超聲波清洗機（SB-120DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子體重秤（ACS，中山市衡新電子有限公司）；大鼠恒溫實驗臺（JR-30，成都泰盟軟件有限公司）；移液槍（100～1000 μl，20～200μl，eppendorf）；手術器械（F套裝，上海玉研手術器械有限公司）。

1.4 頸動脈血栓模型制備大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（2 ml/kg）麻醉，后仰臥位固定，頸部備皮后，皮膚表面先用碘伏涂擦手術野皮膚，用滅菌器材沿頸中線縱行切開頸部皮膚約3 cm，剪開淺筋膜，止血鉗鈍性分離胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌之間的肌間隙，暴露氣管，用玻璃分針分離出右側頸總動脈約3 cm，可在頸動脈滴少量鹽酸利多卡因，防止刺激迷走神經。將自制塑料墊（5 cm×1 cm）置于已分離出頸動脈下方，用來分隔血管與周圍組織，防止周圍組織被腐蝕；移液槍吸20 μl的50% FeCl3溶液倒入事先準備好的濾紙片（1 cm×1 cm）上，并環(huán)敷在右側頸總動脈，用鑷子輕夾接口處使濾紙環(huán)貼緊動脈壁30 min后取下，用生理鹽水沖洗局部組織。假手術組頸總動脈分離方法同上，暴露頸總動脈后，將吸有20 μl生理鹽水的小片濾紙（1 cm×1 cm）環(huán)敷在此段動脈上，30 min后取下，用生理鹽水沖洗局部組織。手術結束后將每只大鼠傷口處滴少量青霉素防止感染，并肌注少量青霉素，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)。

1.5 E-Lisa法檢測大鼠血漿指標大鼠禁食不禁水至少8 h，取血前1.5 h完成末次灌胃給藥后采集血漿樣本，采集后先室溫靜置0.5 h，離心機離心15 min（3000 rpm），取上清，-20℃分裝保存?zhèn)溆?。取出試劑盒，先室溫放?0 min。取出酶標板，按照標準品的次序分別加入100 μl的標準品溶液于空白微孔中?？瞻孜⒖字屑尤?00 μl的樣品，空白對照加入100 μl的磷酸鹽緩沖液（PH 7.0～7.2）。除空白對照外，在其它組各孔中加入50 μl的酶標記溶液。將酶標板用封口膠密封后，保持37℃恒定溫度孵育反應1 h。過后將酶標板反復清洗5次，保持各孔有充足的水壓。酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A 50 μl。各孔加入顯色劑B 50 μl。避光反應10 min后各孔加入50 μl終止液，終止反應。

1.6 統(tǒng)計學方法所有實驗數據均采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。多個樣本均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用最小顯著差異t檢驗法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血栓模型構建情況應用FeCl3外敷頸總動脈誘導血栓形成法構建大鼠頸動脈血栓模型，通過肉眼觀察M組有明顯血栓形成（圖1）。

2.2 各組間血漿指標含量比較與S組比較，M組TXB2含量、TXB2/6-K-PGF1α比值、ET-1含量升高（P＜0.05）；6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。與M組比較，H組、L組6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量升高（P＜0.05），TXB2含量、TXB2/6-K-PGF1α比值顯著降低（P＜0.01）；A組TXB2、PLG含量、TXB2/6-K-PGF1α比值顯著降低（P＜0.01），6-K-PGF1α含量顯著升高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義（表1）。

2.3 各組ET-1含量比較與M組比較，H、L組ET-1含量雖有降低趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表2）。

3 討論

以血栓形成為病理基礎的心腦血管疾病已成為威脅人類健康的頭號“殺手”。血液充盈、心氣充沛和脈道通利等任何一個環(huán)節(jié)的異常都會致使血行不暢，導致血栓形成[2]。阿司匹林作為抑制血小板聚集的藥物，是防治血栓的代表。流行病學調查結果顯示，5%～45%服用阿司匹林的患者未能從抗血小板治療中獲得理想效果，出血傾向及長期服藥導致的肝損害也是阿司匹林表現出的一定副作用[3,4]。

圖1 大鼠經FeCl3環(huán)貼造模前后對比圖

表1 各組TXB2、6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量、TXB2/6-K-PGF1α比值比較（±s）

表1 各組TXB2、6-K-PGF1α、PC、AT-Ⅲ、PLG含量、TXB2/6-K-PGF1α比值比較（±s）

注：TXB2：血栓素B2；6-K-PGF1α：6-酮-前列腺素1α；PC：蛋白C；AT-Ⅲ：抗凝血酶Ⅲ；PLG：纖溶酶原；與假手術組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 TXB2（pg/ml） 6-K-PGF1α（pg/ml） TXB2/6-K-PGF1α PC（ng/ml） AT-Ⅲ（μg/ml） PLG（ng/ml）S 247.20±39.67 32.29±5.91 7.91±2.10 2.96±0.27 20.59±3.18 98.99±13.21 M 299.33±31.37b 26.47±4.85a 11.54±2.55b 2.49±0.57a 17.79±1.66a 80.05±20.36a A 132.25±43.85d 35.96±9.97c 3.73±0.76d 2.09±0.58 19.54±2.66 72.62±36.67 L 259.34±38.38c 33.91±8.68c 5.63±1.33d 3.02±0.52c 21.69±4.37c 164.15±44.92d H 230.45±49.72d 39.67±12.65d 4.14±1.13d 3.39±0.84c 21.53±3.48d 153.35±37.66d

隨著對中藥藥理學不斷深入地研究，證實了多種中藥、中藥有效成分及組方可以發(fā)揮較好的抗血栓作用[5]。中藥抗血栓的作用雖平和，具有作用靶點、通路多，不良反應較小，安全性高，價格低廉等優(yōu)點，中藥為防治血栓提供了一條新的思路[6]。本實驗所使用的益氣活血復方由丹參、西洋參有效部位組合而成。丹參活血化瘀、通經止痛、涼血消癰[7]；西洋參補氣養(yǎng)陰、清熱生津[8]。兩藥有效部位按比例組合，補氣而不壅中，活血而不傷正。

近幾年，通過對血栓形成的研究，發(fā)現血管內皮細胞功能障礙或損傷為血栓形成的始動因素，其中血小板的活化發(fā)揮重要作用。此外凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)的異常也參與了其病理過程[9]。

血栓素A2（TXA2）、前列腺素I2（PGI2）都是花生四烯酸（AA）的重要代謝產物。細胞中的AA正常情況下不會以游離的形式存在，但當遇到組織損傷或者刺激因子時可游離出來，在環(huán)氧化酶作用下轉變?yōu)椴环€(wěn)定的中間代謝產物前列腺素（PG）。血小板中的TXA2合成酶將過氧化物合成為TXA2，EC上的PG合成酶將過氧化物合成為PGI2。TXA2是目前發(fā)現的最強的血小板聚集劑和縮血管物質之一，但性質不穩(wěn)定，很快會轉化為穩(wěn)定、無生物活性的TXB2[10]；PGI2是通過抑制血小板功能和擴張血管來發(fā)揮抗血栓作用的生物活性物質，也極不穩(wěn)定，會迅速轉變?yōu)榉€(wěn)定的但無生物活性的6-K-PGF1α[11]。TXA2和PGI2互為拮抗，生理狀態(tài)下的活性平衡可以保持血管正常的收縮與舒張功能，二者之間一旦平衡失調，則容易導致血栓形成[12]。本實驗結果表明，與S組相比，M組血漿中TXB2含量升高，6-K-PGF1α含量降低（P＜0.01），可能是因為FeCl3化學腐蝕法造成模型血管內皮損傷，導致AA游離，增加TXA2生成；合成PGI2減少，減弱了拮抗TXA2的能力，加速血小板的活化，導致生成血栓。與M組相比，A組對TXB2抑制最為突出，對6-K-PGF1α含量并無影響，推測阿司匹林是通過抑制TXA2的合成來防治血栓生成的。H組、L組與M組相比，均能降低血漿TXB2含量，升高6-K-PGF1α含量，并且能夠降低TXB2與6-K-PGF1α比值，原因可能是復方通過改變花生四烯酸代謝途徑，保持TXB2與6-K-PGF1α比值平衡；通過減少TXA2合成抑制血小板功能亢進，并且促進內皮細胞（EC）功能恢復，分泌PGI2舒張血管、抑制血小板聚集，發(fā)揮抗血栓形成的作用。為此我們推斷，改變AA代謝途徑可能是益氣活血復方抗血栓的作用機制之一。

表2 各組ET-1含量比較（±s）

表2 各組ET-1含量比較（±s）

注：ET-1：內皮素-1；與假手術組比較，aP＜0.05

組別 E T-1（n g/m l）S 0.3 3±0.0 6 M 0.4 5±0.1 7 a A 0.3 7±0.1 4 L 0.4 1±0.1 5 H 0.4 4±0.1 5

在凝血系統(tǒng)中，抗凝血酶（AT）和蛋白系統(tǒng)都扮演重要角色，無論何因引起它們的結構變化或是缺乏減少都可以使得血液抗凝活性降低，導致血栓生成。血漿抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）是體內主要的抗凝物質，由肝細胞產生，反映機體抗凝系統(tǒng)功能，對滅活凝血酶有持久作用，還可滅活其它凝血因子[13-15]。本實驗結果表明，與S組相比，M組中血漿AT-Ⅲ含量降低，可能是因FeCl3化學腐獨法造成血管EC損傷，從而使EC表面AT-Ⅲ減少，同時使內、外源性凝血途徑激活，產生凝血酶消耗AT-Ⅲ使之含量下降。與M組相比，H組、L組均能夠不同程度的升高AT-Ⅲ含量，可能是由于益氣活血復方可以促進機體分泌一些類肝素物質，使得AT-Ⅲ的抗凝活性作用增加，從而滅活凝血酶和凝血-抗凝血酶復合物，抑制血栓的形成。為此我們考慮，增強抗凝系統(tǒng)活性也是益氣活血復方抗血栓的作用機制之一。A組與M組比較，未體現統(tǒng)計學差異，可能其在此通路不發(fā)揮作用或作用不顯著。

蛋白系統(tǒng)中的最主要組成部分是蛋白C（PC），PC本身是酶原，激活后的PC（APC）抗血栓的作用很強，主要體現在PC可以滅活凝血輔因子，APC能使凝血因子FVa和FVⅢa發(fā)生酶解，發(fā)揮滅活作用；對FVa具有酶解滅活作用，阻礙其與血小板結合，從而降低FVa對凝血酶原激活的作用；APC還可刺激纖溶酶促使纖溶蛋白溶解，借助纖維蛋白降解產物以增強自身的抗凝作用[16]。本實驗結果表明，與S組相比，M組PC含量下降，可能是由于形成血栓過程中，血管EC受損、大量凝血酶活化導致PC合成的抗凝因子減少、產生消耗。與M組相比，H組、L組均可使PC含量升高，分析原因，益氣活血復方可能在激活AT-Ⅲ途徑后致使凝血因子失活，對PC的消耗減少、含量升高，進而使APC濃度升高、活性增強，發(fā)揮抑制血栓形成的作用。與M組比較，A組血漿PC含量未體現統(tǒng)計學差異，可能其在此通路不發(fā)揮作用或作用不顯著。

正常人體的纖溶系統(tǒng)在防止出血、保持管道通暢、阻止血栓生成發(fā)揮重要的作用。纖溶系統(tǒng)最核心的成分是纖溶酶原（PLG）[17]。在活化劑的作用下，PLG轉化為纖溶酶（PL）是纖溶過程中極為重要的一步。但PL性質不穩(wěn)定，少量在血循環(huán)中出現的PL會被a2-抗纖溶酶迅速滅活，因此不易直接檢測，可通過測定PLG的含量來間接得知PL的活性水平[18,19]。本實驗的結果表明，與S組相比，M組PLG含量下降，可能是因血栓形成過程中，血液中PLG與局部纖維蛋白結合，致使游離的PLG含量減少。與M組相比，H組、L組PLG含量顯著升高，由此我們推斷，PLG含量的升高使得t-PA活性增強，從而增強了纖溶功能，可以抑制凝血過程甚至溶解已經形成的栓子，發(fā)揮抗血栓的作用。與S組相比，M組的血漿PLG含量與模型組比較未體現統(tǒng)計學差異，可能其在此通路不發(fā)揮作用或作用不顯著。

內皮素（ET）是一種具有血管活性的多肽，于1988年由 Yanagisawa等從豬的主動脈內皮細胞培養(yǎng)液中提取[20,21]，在機體各組織、細胞中分布廣泛，是一種極強的縮血管物質，可維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和基礎血管張力。ET-1增多見于血栓前狀態(tài)、各類心絞痛等，ET-1含量較高，形成血栓的可能性要高于ET-1含量正常的群體。本實驗結果表明，與M組相比，H組、L組對血漿ET-1含量的影響雖有降低趨勢，但并無統(tǒng)計學差異，原因很可能是益氣活血復方在此通路作用不顯著。

本研究結果研究發(fā)現，在體外實驗中，益氣活血復方可從抑制血小板活化、改善凝血狀態(tài)及激活纖溶系統(tǒng)等不同作用環(huán)節(jié)抑制血栓形成。本課題組在總結益氣活血復方能有效改善血栓形成作用機制的同時，仍需進一步進行更深入的相關作用通路及靶點研究，以期為日后的臨床應用提供更為有價值的實驗證據。丹參和西洋參的聯(lián)合應用也成為臨床遣藥組方治療疾病的方向之一。